RNA干擾矽肺纖維化相關(guān)基因CXCL11-CXCR3對人胚肺成纖維細(xì)胞I、III型膠原表達(dá)的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗購入人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5細(xì)胞），通過 RNA干擾技術(shù)將CXCL11-SiRNA和CXCR3-SiRNA干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入人胚肺成纖維細(xì)胞內(nèi)，對矽肺纖維化相關(guān)基因CXCL11及CXCR3進(jìn)行基因沉默，并用矽肺患者肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激人胚肺成纖維細(xì)胞，觀察細(xì)胞I、III型膠原表達(dá)情況，探討CXCL11及CXCR3在矽肺纖維化中的作用。
　　方法：1獲取矽肺患者肺泡灌洗液，離心收集肺泡巨噬細(xì)胞（AM），觀察 AM

2、形態(tài)，并做常規(guī) HE染色、抗酸染色及瑞氏染色鑒定。用含 SiO2的空白培養(yǎng)基刺激AM18h，收集上清并過濾保存?zhèn)溆谩?構(gòu)建 ShRNA表達(dá)質(zhì)粒：在 Pubmed網(wǎng)站查詢獲得人類基因CXCL11及CXCR3的序列號，由上海吉瑪公司構(gòu)建兩種基因的干擾質(zhì)粒及相應(yīng)的陰性質(zhì)粒，質(zhì)粒選取 pGPU6/GFP/Neo-shGAPDH為載體。3 CXCL11-SiRNA和CXCR3-SiRNA由 LipofectamineTM2000脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染

3、入人胚肺成纖維細(xì)胞內(nèi)，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況；轉(zhuǎn)染36～48h后提取各組細(xì)胞總 mRNA和總蛋白分別用 realtime-PCR和Western-blot法篩選兩個基因的最佳干擾序列。4實(shí)驗分為4組：空白對照組（C組），常規(guī)10％胎牛血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；刺激組（S組），常規(guī)10％胎牛血清MEM培養(yǎng)基中加入之前保存?zhèn)溆玫姆闻菥奘杉?xì)胞培養(yǎng)上清；轉(zhuǎn)染組（T組），將篩選的最佳干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細(xì)胞后，常規(guī)10％胎牛血清

4、MEM培養(yǎng)基中再加入保存?zhèn)溆玫姆闻菥奘杉?xì)胞培養(yǎng)上清；陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（N組），將陰性干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，常規(guī)10％胎牛血清 MEM培養(yǎng)基中再加入保存?zhèn)溆梅闻菥奘杉?xì)胞培養(yǎng)上清。5免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western-blot法檢測I、III型膠原的表達(dá)：分別在 SiO2刺激后的12h、24h、36h、48h和72h檢測各組人胚肺成纖維細(xì)胞I、III型膠原蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細(xì)胞36～48h后，激光掃描共聚焦顯微

5、鏡觀察到綠色熒光蛋白在人胚肺成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)，其中當(dāng)質(zhì)粒:LipofectamineTM2000脂質(zhì)體=3μg:3μl時，轉(zhuǎn)染率最高，可高達(dá)90％以上。2提取各組總 mRNA和總蛋白，分別用realtime-PCR和Western-blot法篩選CXCL11和CXCR3干擾效果最好的序列：其中 CXCL11的最佳干擾質(zhì)粒為 pGPU6/GFP/Neo-CXCL11-homo-352；CXCR3的最佳干擾質(zhì)粒為 pGPU6/GFP/N

6、eo-CXCR3-homo-203；未轉(zhuǎn)染組和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，統(tǒng)計學(xué)分析差異無顯著性（P＜0.05）。3免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western-blot法檢測結(jié)果均顯示：空白對照組細(xì)胞均有少量I、III型膠原蛋白的表達(dá)；刺激組與同時間點(diǎn)空白對照組相比，I、III型膠原蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染組與同時間點(diǎn)空白對照組相比，I、III型膠原蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），但與同時間點(diǎn)刺激組相比，I、III型膠原蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）