SPARC對增生性瘢痕成纖維細胞Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達的影響.pdf

1、目的：應用SYBR熒光實時定量RT-PCR法檢測富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白（SPARC）對增生性瘢痕成纖維細胞I型膠原蛋白表達的影響。
　　 方法：①成纖維細胞體外原代培養(yǎng):手術取4例增生性瘢痕（hypertrophic scar)（上肢、下肢、腹部、后背各一例），兩例來自安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院整形外科手術病例，兩例來自安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院燒傷科手術病例。按文獻方法進行成纖維細胞原代培養(yǎng)，待細胞融合后傳代，實驗所用細胞均

2、為處于3-5代對數(shù)生長期的成纖維細胞。②將不同濃度重組人SPARC(終濃度為2.5、5、10pmol·L-1)對3-5代增生性瘢痕成纖維細胞分別進行干預3h。用Trizol試劑提取成纖維細胞總RNA，核酸測定儀測OD值，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量，逆轉錄反應獲得的cDNA-20℃保存。稀釋cDNA成5個梯度(104、103、102、101、100)，分別進行靶基因collagen type I及內(nèi)參基因β-actin的SYBR G

3、reen I實時定量PCR反應，制備兩組基因的標準曲線并檢測擴增效率。③將PCR產(chǎn)物作熔解曲線分析，并進行1％瓊脂糖凝膠電泳，確定產(chǎn)物特異性。Collagen type I mRNA相對表達量采用Comparative Delta-delta Ct法進行分析。④各組均數(shù)之間比較采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行方差分析及兩兩比較的t檢驗。
　　 結果：４例增生性瘢痕標本原代培養(yǎng)成纖維細胞成活良好，傳至３-５代用于實驗，用不同濃度

4、SPARC作用3h后，終止培養(yǎng)，進入結果分析。①提取的總RNA進行1％瓊脂糖凝膠電泳，確定產(chǎn)物特異性，結果顯示提取的總RNA質量純，無明顯降解，可以進行下一步的RT-PCR反應。②將逆轉錄產(chǎn)物經(jīng)95℃ 10s變性,然后95℃ 5s，60℃ 30s重復50個循環(huán)進行擴增，用Rotor Gene3000系統(tǒng)Comparative Delta-delta Ct法進行分析，結果與空白對照組相比，SPARC2.5pmol·L-1、5pmol·L-

5、1、SPARC10.0pmol·L-1實驗組collagen type I mRNA表達量分別增加1.5、3.4、3.9倍。③各組均數(shù)之間比較采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行方差分析及兩兩比較的t檢驗(P<0.05)，顯示差異具有統(tǒng)計學意義。④將PCR產(chǎn)物作熔解曲線分析，結果顯示collagen type I及β-actin基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰值分別為85℃及89℃，熔解溫度均一，為單一銳利主峰，說明無引物二聚體及非特異性擴增，