Hsa-microRNA-138-5p靶向調(diào)控FOXC1和Vimentin抑制胰腺癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、第一部分 Hsa-microRNA-138-5p在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：篩選胰腺癌及對應(yīng)癌旁組織中差異表達(dá)的microRNA(miRNA)，擴大樣本數(shù)量，判斷目標(biāo)miRNA在胰腺癌組織、胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法：采用miRNA表達(dá)譜芯片分析3對胰腺癌及對應(yīng)癌旁組織中miRNA的差異性表達(dá)；實時定量PCR檢測目標(biāo)miRNA（hsa-miR-138-5p）在擴大樣本量的18對胰腺癌、對應(yīng)癌旁組織及8株胰腺癌細(xì)胞、正常

2、胰腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況；收集臨床病例資料，分析miR-138-5p的表達(dá)水平與胰腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果：胰腺癌組織差異性表達(dá)miRNAs80條，其中高表達(dá)68條、低表達(dá)12條，其中miR-138-5p在3對胰腺癌中總體低表達(dá)，而對應(yīng)癌旁組織高表達(dá)，差異倍數(shù)3.64倍。擴大樣本顯示，miR-138-5p在胰腺癌組織中的表達(dá)比癌旁低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其表達(dá)水平與胰腺癌病理分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率相關(guān)；miR-138-5p在8株

3、胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)分別比正常胰腺細(xì)胞低1～10倍，且分化、增殖侵襲能力不同的胰腺癌細(xì)胞miR-138-5p表達(dá)水平也有所差異。結(jié)論：miR-138-5p在原發(fā)性胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞系中呈低表達(dá)水平，與胰腺癌病理分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率相關(guān)。
　　第二部分 Hsa-microRNA-138-5p對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響
　　目的：探討miRNA-138-5p對胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)、外增殖能力的影響。方法：構(gòu)建miR-138-5

4、p過表達(dá)慢病毒載體、抑制載體，感染胰腺癌細(xì)胞株，實時定量PCR檢測感染效率；CCK-8、平板克隆形成實驗、EdU細(xì)胞增殖法檢測miR-138-5p對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-138-5p對胰腺癌細(xì)胞周期的影響；構(gòu)建裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型，檢測miR-138-5p對胰腺癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力的影響。結(jié)果：成功構(gòu)建miR-138-5p慢病毒載體，CCK-8、平板克隆實驗、EdU細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，上調(diào)胰腺癌細(xì)胞miR-

5、138-5p表達(dá)可顯著降低胰腺癌細(xì)胞株增殖能力、下調(diào)miR-138-5p表達(dá)后胰腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯加強，相對于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；FCM結(jié)果顯示，上調(diào)胰腺癌細(xì)胞miR-138-5p表達(dá)可阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期；裸鼠皮下成瘤實驗顯示，miR-138-5p可抑制胰腺癌細(xì)胞皮下成瘤能力。結(jié)論：miR-138-5p對胰腺癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，抑制胰腺癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力，其作用至少部分是通過阻滯細(xì)胞于 G0/G1期而

6、實現(xiàn)的。
　　第三部分 Hsa-microRNA-138-5p對胰腺癌細(xì)胞侵襲性和化療敏感性的影響
　　目的：探討miR-138-5p對胰腺癌細(xì)胞體、內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力和化療敏感性的影響。方法：細(xì)胞劃痕實驗檢測miR-138-5p對胰腺癌細(xì)胞遷移能力的影響；Transwell小室侵襲實驗檢測miR-138-5p對胰腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響；選擇胰腺癌臨床常用化療藥物（吉西他濱和5-氟尿嘧啶），CCK-8檢測miR-138-5p對

7、胰腺癌細(xì)胞化療敏感性的影響；構(gòu)建裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，檢測miR-138-5p對胰腺癌細(xì)胞在動物體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果：上調(diào)miR-138-5p表達(dá)可顯著降低胰腺癌細(xì)胞株遷移和侵襲轉(zhuǎn)移能力、下調(diào)miR-138-5p表達(dá)后胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲轉(zhuǎn)移能力下降，相對于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；miR-138-5p可增加胰腺癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性，其24h、48h及72h實驗組IC50值較陰性對照組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；裸鼠

8、胰腺癌肝臟轉(zhuǎn)移模型顯示，miR-138-5p可抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞在肝臟微轉(zhuǎn)移灶的形成，相對于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：miR-138-5p能降低胰腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力，增加胰腺癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性，減少裸鼠體內(nèi)胰腺癌肝轉(zhuǎn)移模型中肝臟遠(yuǎn)處微轉(zhuǎn)移灶的形成。
　　第四部 Hsa-microRNA-138-5p的靶基因鑒定及其調(diào)控人胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的機制
　　目的：明確miR-138-5p抑

9、制胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的作用靶點及機制，闡明miR-138-5p作用靶基因的生物學(xué)功能。方法：運用TargetScan，miRanda，MicroCosm等多個miRNAs靶基因的數(shù)據(jù)庫對miR-138-5p靶基因進(jìn)行預(yù)測，初步篩選出2個與腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的潛在靶基因——叉頭框蛋白C1(FOXC1)和波形蛋白（Vimentin,VIM)，采用雙熒光素酶報告基因分別驗證miR-138-5p與FOXC1的3’非翻譯區(qū)（3’UT

10、R）及VIM的3’UTR存在靶向序列，確定它們的直接靶向調(diào)控關(guān)系，實時定量PCR及western blot進(jìn)一步驗證miR-138-5p對胰腺癌細(xì)胞FOXC1和VIM基因 mRNA及蛋白水平表達(dá)影響；利用小干擾RNA（siRNA）檢測靶基因FOXC1和VIM對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。最后，采用western blot及免疫熒光對相關(guān)通路蛋白進(jìn)行初步探討。結(jié)果：熒光素酶報告實驗顯示，miR-138-5p可直接結(jié)合于FOXC1、VIM的

11、3’UTR，實時定量PCR、western blot也觀察到miR-138-5p可明顯抑制FOXC1、VIM基因mRNA和蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；FOXC1、VIM在胰腺癌組織中明顯低表達(dá)；siRNA下調(diào)胰腺癌細(xì)胞 FOXC1表達(dá)后（模擬miR-138-5p的作用）胰腺癌細(xì)胞增殖能力減弱；siRNA下調(diào)胰腺癌細(xì)胞 VIM表達(dá)后（模擬miR-138-5p的作用）胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱，當(dāng)同時抑制胰腺癌細(xì)胞miR-138-5p和F

12、OXC1的表達(dá)后，CCK-8結(jié)果顯示，單獨轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，單獨轉(zhuǎn)染miR-138-5p inhibitor組細(xì)胞數(shù)目明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而兩者同時轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)目基本恢復(fù)至對照組水平，與對照組比較，差異統(tǒng)無計學(xué)意義，說明抑制FOXC1表達(dá)能減少miR-138-5p inhibitor引起的促進(jìn)細(xì)胞增殖的效應(yīng)；當(dāng)同時抑制細(xì)胞中miR-138-5p和VIM的表達(dá)后，Transwell小室侵襲實驗顯示，單獨

13、轉(zhuǎn)染VIM siRNA組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，單獨轉(zhuǎn)染miR-138-5p inhibitor組細(xì)胞數(shù)目明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而兩者同時轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲數(shù)目基本恢復(fù)至對照組水平，與對照組比較，差異統(tǒng)無計學(xué)意義，說明抑制 VIM表達(dá)能減少miR-138-5p inhibitor引起的促進(jìn)細(xì)胞侵襲效應(yīng)。Western blot對FOXC1下游可能作用基因進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示，細(xì)胞周期蛋白CNND1的表達(dá)顯著降低；Western blot結(jié)果