砂生槐種子生物堿抗包蟲效應及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　包蟲病是主要由棘球蚴或泡球蚴寄生于人體或動物體內引起的人獸共患寄生蟲病，在全球廣泛流行，嚴重危害人類健康和生命安全。目前，治療包蟲病以手術為主，但無法耐受手術或病情復雜而無法進行手術的患者，只能依賴藥物治療，而獲批臨床使用的藥物僅有阿苯達唑和甲苯達唑兩種，品種單一，療效不理想，并且發(fā)現(xiàn)副作用多而嚴重，耐藥現(xiàn)象日益增多。因此，亟需研發(fā)療效明確、副作用小的抗包蟲藥物。從祖國傳統(tǒng)醫(yī)學的數(shù)千年治療蟲病的經驗中尋找線索，是發(fā)

2、掘抗包蟲藥物的一個重要途徑。砂生槐為青藏高原特有植物，藏醫(yī)記載其種子性苦、寒，具有治療白喉、蟲病、中毒癥、消化不良等功效。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)砂生槐種子親脂性總生物堿在體外具有殺滅細粒棘球蚴原頭節(jié)活性，在體內可抑制小鼠繼發(fā)性棘球蚴生長，提示砂生槐種子總堿中含有驅蟲成分。但砂生槐種子在藏醫(yī)中以水煎劑入藥，親脂性總堿水溶性差、抗蟲效果弱，因此，本課題從砂生槐種子的水溶性成分中尋找有效的抗包蟲成分并研究其抗蟲機制。
　　研究方法：<

3、br>　　以乙醇為溶劑，采用熱回流提取法分離砂生槐種子生物堿，以秀麗隱桿線蟲為模型，對砂生槐種子的分離產物進行殺蟲活性篩選。采用柱層析分離法，從殺蟲活性較強的成分中提取極性較小的餾分和極性較大的餾分，TLC定性鑒定餾分的成分，通過秀麗隱桿線蟲確定砂生槐種子的殺蟲活性成分，并通過HPLC分析其主要化學成分。分離自然感染羊肝細粒棘球蚴原頭節(jié)，在體外與砂生槐種子成分共同培養(yǎng)7天，觀察原頭節(jié)形態(tài)變化及存活情況，進一步確定砂生槐種子的殺蟲活性成分

4、。
　　NIH小鼠腹腔注射細粒棘球蚴原頭節(jié)建立慢性棘球蚴病模型，BALB/c小鼠腹腔注射泡球蚴建立慢性泡球蚴病模型，分別于感染后20 w和14 w用砂生槐種子殺蟲活性成分灌胃治療，劑量為100 mg/kg/day，治療6 w后剖殺小鼠檢測。剝離棘球蚴囊泡組織，稱量濕重，常規(guī)HE染色；FCM分析脾臟CD3+、CD4+、CD8+和PD-1+的T細胞亞群；ELISA檢測IFN-γ和IL-4水平；CFSE染色檢測脾細胞增殖能力。以秀麗隱桿

5、線蟲為模式生物，檢測砂生槐種子殺蟲活性成分作用后秀麗隱桿線蟲的運動行為能力、生殖能力、壽命、體長及ROS水平，反映其抗蟲機制。體外培養(yǎng)肝細胞株HepG-2細胞和Chang liver細胞，MTT法檢測砂生槐種子殺蟲活性成分對細胞生長的影響；BALB/c小鼠口服砂生槐種子殺蟲活性成分（100 mg/kg/day）6 w后，檢測血清肝腎生化指標和病理變化，評價砂生槐種子殺蟲活性成分的毒副作用。Ⅲ型干擾素成員IL-28B與抗原EAMMH在0、

6、3、6 w同時注射 C57BL/6小鼠，10 w分離脾細胞， FCM分析CD4+CD25+Foxp3+Treg占脾淋巴細胞比例，ELISPOT檢測分泌IFN-γ的T細胞數(shù)目，間接ELISA檢測抗原特異性IgG1和IgG2c水平，反映IL-28B對Treg及免疫應答的調節(jié)作用，為其應用于包蟲病治療奠定基礎。
　　研究結果：
　　本課題從砂生槐種子獲得4種提取物：非水溶性生物堿（E1）、水溶性生物堿（E2）、水溶性非生物堿（E3

7、）和不溶性非生物堿（E4）。E1、E2、E3和 E4的殺秀麗隱桿線蟲的24 h-LC50分別為31.03 mg/ml、14.29 mg/ml、29.94 mg/ml和25.64 mg/ml，E2的LC50最低。從E2中提取到極性較小的餾分E2-a和極性較大的餾分E2-b。E2-a和E2-b殺秀麗隱桿線蟲的24 h-LC50分別是9.06 mg/ml和36.24 mg/ml。TLC定性鑒定，E2-a含有苦參堿和槐果堿，E2-b含有氧化苦參

8、堿和氧化槐果堿?？鄥A和槐果堿殺秀麗隱桿線蟲的24 h-LC50分別是12.03 mg/ml和9.81 mg/ml。HPLC分析100μg/ml E2-a中苦參堿和槐果堿的含量分別為42.8μg/ml和25.7μg/ml。E2-a體外作用于細粒棘球蚴原頭節(jié)后，蟲體出現(xiàn)皺縮、一端或兩端出現(xiàn)氣泡、吸盤變形、頂突明顯外翻等異常表現(xiàn)，活性降低。E2-b、E2、苦參堿、槐果堿在體外對原頭節(jié)活性均有不同程度影響。殺原頭節(jié)的72 h-LC50值由低到

9、高依次是E2-a（0.35 mg/ml）、E2（0.45 mg/ml）、槐果堿（0.79 mg/ml）、苦參堿（1.16 mg/ml）、E2-b（2.12 mg/ml），E2-a的LC50值最低。
　　治療小鼠慢性棘球蚴病的結果表明， E2-a組的棘球蚴囊泡組織濕重（8.40±2.93 g）明顯低于陰性對照組（11.33±1.64 g）（p=0.042）；E2-a組的囊泡生發(fā)層與角皮層部分剝離，角皮層增厚，變得疏松，出現(xiàn)大量泡狀物

10、，失去典型的紋狀結構，與外膜之間的界限變得模糊不清；E2-a組小鼠脾臟CD3+T細胞占脾淋巴細胞的比例（45.14％±23.93%）高于陰性對照組（14.74%±9.39%）（p=0.011），且主要是 CD4+T細胞比例（72.28%±3.63%）高于陰性對照組（50.33%±27.92%）（p=0.036）所致，CD8+T比例無明顯升高或降低（p>0.05）；E2-a組小鼠 PD-1+T細胞比例（9.92%±6.77%）顯著低于陰性

11、對照組（25.51%±13.53%）（p=0.009），且CD4+PD-1+T細胞比例為5.73%±1.62%，明顯低于陰性對照組（12.59%±6.35%）（p=0.023），CD8+PD-1+T細胞比例為0.86%±0.35%，明顯低于陰性對照組（2.77%±1.87%）（p=0.020）；E2-a組小鼠血清IFN-γ水平無明顯變化，血清IL-4濃度平均為4.21 pg/ml，與陰性對照組（1.13 pg/ml）比較有升高

12、趨勢；E2-a組抗原刺激后脾細胞培養(yǎng)上清中IL-4濃度平均為5.75 pg/ml，與陰性對照組（3.10 pg/ml）比較有升高趨勢；E2-a組小鼠脾細胞增殖能力無增高。治療慢性泡球蚴病小鼠的結果表明，E2-a組小鼠的泡球蚴囊泡組織濕重為6.10±2.16 g，顯著低于陰性對照組（11.25±1.73 g）（p<0.01），平均降低囊重約5.15 g；E2-a組小鼠血清INF-γ水平無降低，IL-4濃度平均為48.46 pg/ml，較陰

13、性對照組（32.08 pg/ml）明顯升高（p=0.032）。
　　秀麗隱桿線蟲的運動行為能力檢測結果表明，8 mg/ml的E2-a作用24 h后，引起秀麗隱桿線蟲的身體彎曲頻率降為陰性對照組的1/3（p<0.01）；頭部擺動頻率平均為34.5次/min，明顯低于陰性對照組（59.1次/min）（p<0.01）；咽泵頻率平均為38.9次/min，低于陰性對照組（71.4次/min）（p<0.01）。E2-a能夠抑制秀麗隱桿線蟲的排

14、卵功能，8 mg/ml的E2-a處理后的秀麗隱桿線蟲每條蟲排卵總數(shù)平均為205.2，明顯低于陰性對照（248.8/蟲）（p<0.01），在第3天和第4天的排卵量分別平均為36.8/蟲和13.2/蟲，明顯低于陰性對照組（分別為54.4/蟲和28.2/蟲）（p<0.05），但AO染色未發(fā)現(xiàn)生殖細胞凋亡增多。8 mg/ml E2-a組線蟲的壽命為9.1±4.1天，明顯低于陰性對照組（13.0±4.6天）（p=0.021）。8 mg/ml E2

15、-a組線蟲的體長平均為447.6 pixels，明顯短于陰性對照組（486.8 pixels）（p<0.01）。E2-a無誘導ROS水平升高的作用。
　　體外MTT實驗證明，濃度為1 mg/ml的E2-a作用48 h后，HepG-2細胞和Chang liver細胞的抑制率分別為29.03%和38.36%，因此低濃度E2-a對肝細胞株HepG-2和Chang liver細胞的增殖有一定抑制作用。小鼠口服E2-a后檢測血清肝腎生化指標

16、，發(fā)現(xiàn)反映肝功能的指標谷丙轉氨酶（38.333 U/L±4.726 U/L）和谷草轉氨酶（150.000 U/L±35.763 U/L）較陰性對照組（谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶分別為33.333 U/L±7.638U/L和139.667 U/L±30.172 U/L）略升高，反映腎功能的的指標肌酐（18.000μM/L±1.000μM/L）較陰性對照組（11.000±7.211μM/L）略升高，但均無統(tǒng)計學差異，其余指標無明顯升高或降低，組

17、織學檢查未發(fā)現(xiàn)肝腎細胞出現(xiàn)明顯改變。
　　包蟲感染中Treg增多，造成感染持續(xù)，故下調Treg是治療包蟲病的策略之一，本課題研究了Ⅲ型干擾素成員 IL-28B對 Treg的調節(jié)作用。結果表明， EAMMH-rAd-mIL-28B組的Treg比例為0.17%±0.17%，顯著低于非特異性對照EAMMH-rAd-EGFP（0.76%±0.25%）（p<0.05）；EAMMH-rAd-mIL-28B組小鼠分泌 IFN-γ的脾細胞數(shù)較對照

18、組無明顯升高；與 EAMMH組比較， EAMMH/rAd-mIL-28B組的IgG1水平有增高趨勢，而IgG2c水平降低（p<0.05）。
　　研究結論：
　　砂生槐種子生物堿中抗蟲活性較強的是低極性的水溶性生物堿 E2-a，其主要化學成分為苦參堿和槐果堿（68.5%）。E2-a抗包蟲的機制為損傷囊泡、誘導CD4+T細胞增多、下調T細胞表面負調節(jié)分子PD-1的表達、調節(jié)IFN-γ和IL-4，促進免疫功能。E2-a能夠影響秀麗