桃蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、我國(guó)是世界上桃[Prunuspersica(L.)Batsch.]的原產(chǎn)地，桃在人民生活和園藝產(chǎn)業(yè)占有非常重要的地位。近年來(lái)，隨著生產(chǎn)的發(fā)展和人民生活水平的提高，品種更豐富、品質(zhì)更優(yōu)越的桃的生產(chǎn)成為我國(guó)北方落葉果樹(shù)中非常重要的課題之一。所有果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量很大程度上決定于果實(shí)內(nèi)所含碳水化合物的種類(lèi)和數(shù)量，桃果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)也高度依賴(lài)于糖類(lèi)的裝載和卸載水平。蔗糖是同化物從源到庫(kù)的長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)闹饕问?，而蔗糖的裝載、卸載和分配則主要依賴(lài)于膜上

2、的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但目前關(guān)于桃等核果類(lèi)植物中是否存在有功能的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)糖類(lèi)的跨膜運(yùn)輸并不清楚。尤其是庫(kù)器官中碳水化合物從韌皮部卸出以及此后的代謝途徑和分子機(jī)理還不甚明了。本文報(bào)道了一個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白新基因，并對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、表達(dá)特征進(jìn)行分析，進(jìn)而構(gòu)建了原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)融合表達(dá)，為深入研究該基因功能奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)各組織總RNA的提取。桃葉片總RNA的提取采用改良Trizol法;果實(shí)總RNA的提取采

3、用CTAB法;枝條韌皮部、花瓣、萼片等組織總RNA的提取采用SDS-苯酚法;得到了完整性好，無(wú)降解，純度高，28S和18S條帶分離清楚的總RNA，能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。
　　(2)桃蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆和序列分析。克隆的桃蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因包含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)，長(zhǎng)度1500bp，編碼499個(gè)氨基酸，具有12個(gè)跨膜區(qū)，41個(gè)氨基酸的中央胞質(zhì)環(huán)，分子量約為53.48kD，等電點(diǎn)為9.23，屬于堿性蛋白，并且不含信號(hào)肽。推導(dǎo)氨基

4、酸序列分析顯示，該基因含有保守的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能域，屬于MFS(Majorfacilitatorsuperfamily)蛋白家族和GPH超家族（GPHfamilysucrose/H+symporter）中的一員。其氨基酸序列與梨、蘋(píng)果的同源性最高，都為87％。核苷酸序列分析顯示，與蘋(píng)果的相似性最高，為90％，草莓、大豆、獼猴桃、黃瓜的相似性分別為85％、76％、76％、75％。進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)分析，結(jié)果表明:蘋(píng)果和梨聚類(lèi)在同一分支上，

5、但它們編碼的氨基酸序列進(jìn)化距離不同步，后與桃PpSUT1聚為一類(lèi)，親緣關(guān)系最近;因此推測(cè)桃PpSUT1的功能與蘋(píng)果MdSUT1的功能相似。與牡丹的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明MFS家族基因編碼的氨基酸序列在進(jìn)化過(guò)程中可能存在種屬差異性。
　　(3)桃蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的時(shí)空表達(dá)。應(yīng)用Real-TimePCR技術(shù)來(lái)研究桃蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)特征。在桃的葉片、韌皮部、果實(shí)、花瓣、雌蕊、雄蕊、萼片組織中均檢測(cè)到PpSUT1有表達(dá)，并在不同

6、組織不同時(shí)期表達(dá)量存在明顯的差異。桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中蔗糖含量的變化與蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量呈正相關(guān)。
　　(4)桃pMAL-c2x-PpSUT1原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定。將蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的中央胞質(zhì)環(huán)片段亞克隆到原核表達(dá)載體pMAL-c2x中，經(jīng)菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定、測(cè)序鑒定，確定桃SUT基因插入的位置、大小、方向均正確，證實(shí)成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體。
　　(5)桃pMAL-c2x-PpSUT1在大腸桿菌中的表達(dá)。將獲得的重組質(zhì)