基于TGF-β信號通路探討疏通肺絡灸法對肺纖維化的拮抗機制.pdf

1、目的：肺纖維化是一種原因不明的進展性、致死性肺間質(zhì)性疾病。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）在肺纖維化過程中扮演了重要角色，其不僅能激活下游Smad信號通路進而誘導上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化，還能調(diào)控各種細胞因子加劇細胞外基質(zhì)的沉積。本課題擬在前期研究基礎之上，采用疏通肺絡治法，觀察艾灸（肺俞、膏肓俞）在治療博萊霉素誘導肺纖維化模型大鼠的過程中，對TGF-β信號通路關(guān)鍵節(jié)點的調(diào)控機制，為提高防治肺纖維化療效提供理論基礎和實驗依據(jù)。
　　方

2、法：3月齡SPF級健康SD大鼠88只，雄性，體重180±20g。將大鼠隨機分組，每組8只：正常組（N）；模型（M）組：模型7天（M7）組、模型11天（M11）組、模型23天（M23）組、模型35天（M35）組；艾灸組（A）：艾灸11天（A11）組、艾灸23天（A23）組、艾灸35天（A35）組；陽性對照潑尼松組（P）組：潑尼松11天（P11）組、潑尼松23天（P23）組、潑尼松35天（P35）組。除正常組按造模方法予以氣管內(nèi)一次性注射等

3、體積的生理鹽水外，其他組均按照氣管內(nèi)一次性注入博萊霉素5mg/Kg方法復制肺纖維化模型。造模后第2天開始治療，潑尼松組給予潑尼松混懸液灌胃，艾灸組給予艾灸肺俞和膏肓俞，模型組與艾灸組采取同樣的抓取固定方法，正常組不予干預。逐日觀察并記錄大鼠呼吸、毛色、精神狀態(tài)、活動性及體重變化等一般情況。分別于第7、11、23、35天四個時間點取材，動態(tài)觀察肺纖維化過程中TGF-β信號通路誘導上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化和細胞外基質(zhì)的變化。取大鼠右肺組織稱

4、取其濕重并計算其肺系數(shù)，ELISA測定肺組織羥脯氨酸（HYP）水平。HE和MASSON染色觀察艾灸對肺纖維化模型大鼠組織形態(tài)的影響。通過ELISA法檢測大鼠肺組織中TGF-β的表達水平，實時熒光定量PCR法檢測上皮細胞標記物E-鈣黏蛋白（E-cad），間質(zhì)細胞標記物α-平滑肌蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vim）等基因mRNA表達的動態(tài)改變，探討艾灸對TGF-β通路介導上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化的調(diào)控機制。采用ELISA法檢測細胞外基質(zhì)主

5、要成分（COL-Ⅰ、COL-III、HA、LN）含量；實時熒光定量PCR法檢測肺組織金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP-2）/金屬基質(zhì)蛋白酶9（MMP-9）及金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制劑1（TIMP-1）/金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制劑2（TIMP-2）基因表達水平；免疫組化法檢測Ⅰ型膠原、III型膠原蛋白表達情況，系統(tǒng)深入地探討艾灸對肺纖維化模型大鼠肺組織細胞外基質(zhì)主要成分代謝的調(diào)節(jié)作用機制。
　　結(jié)果：1.艾灸組動物一般狀況較模型組有較大改善。正

6、常組大鼠呼吸均勻平穩(wěn)，毛發(fā)光亮，精神較好，反應靈敏，體重正常持續(xù)增長；模型大鼠呼吸急促，皮毛無光澤，精神萎靡，唇甲青紫，弓背蜷縮，反應差，體重較治療組和正常組增長緩慢；經(jīng)艾灸治療后，艾灸組比模型組一般情況有較大改善，潑尼松組與艾灸組無明顯差異。
　　2.艾灸組肺系數(shù)及肺組織羥脯氨酸含量有明顯降低。與正常組相比，模型組和治療組經(jīng)造模后各組肺系數(shù)明顯升高，且有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型23天組和35天組肺系數(shù)較艾灸組高，但不具統(tǒng)

7、計學意義，且艾灸在35天治療結(jié)束后肺系數(shù)最為接近正常組。模型組、艾灸組和潑尼松組肺組織羥脯氨酸含量均顯著大于正常組，且有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與同期模型組比，艾灸組、潑尼松組肺組織羥脯氨酸含量均有明顯降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.05），經(jīng)治療35天后艾灸組肺組織羥脯氨酸含量有明顯降低與正常組最為接近。
　　3.病理觀察發(fā)現(xiàn)，艾灸組炎性細胞浸潤和膠原纖維增生明顯減弱。HE染色和MASSON染色結(jié)果顯示：正常組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺

8、泡間隔未見增厚、水腫、炎癥及纖維化表現(xiàn)，肺泡腔內(nèi)未見明顯滲出，肺組織比較正常。模型7天組肺間質(zhì)內(nèi)見巨噬細胞和中性粒細胞等炎性細胞浸潤，肺間質(zhì)增寬。模型11天組肺泡壁增厚明顯，肺泡間質(zhì)內(nèi)仍可見大量的炎性細胞浸潤。模型23天組部分肺泡融合，肺泡間質(zhì)內(nèi)可見大量的炎性細胞浸潤和膠原纖維增生。模型35天組間質(zhì)中度增厚，肺間質(zhì)內(nèi)可見大量纖維細胞。模型組、艾灸組潑和尼松組肺泡炎程度和肺纖維化程度較正常組嚴重，艾灸35天組膠原纖維沉積較潑尼松組、模型組

9、減少。
　　4.艾灸對肺纖維化模型大鼠肺組織上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化有顯著抑制作用。肺纖維化模型大鼠肺組織TGF-β含量在11天達到高峰，與正常組比較有顯著性差異（P<0.05），艾灸組和潑尼松組TGF-β含量較模型組明顯降低，艾灸組在11天和23天時跟模型組比有顯著差異（P<0.05）。模型7天組E-cad的mRNA表達量明顯下降，與正常組比有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；11天和23天艾灸組與模型組E-cad的mRNA表達量比較

10、，艾灸組表達量明顯高于模型組，且有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；35天組艾灸組與模型組不具統(tǒng)計學意義（P>0.05）。模型組和艾灸組α-SAM和vimentin的mRNA表達趨勢大致相似：均從11天到23天呈上升趨勢，23天至35天呈下降趨勢。且艾灸組上升和下降的幅度均小于模型組。且模型組各時間點α-SAM和vimentin的mRNA表達量均高于艾灸組和潑尼松組。
　　5.艾灸顯著性抑制肺纖維化模型大鼠肺組織細胞外基質(zhì)合成與沉積。主

11、要成分：模型7天組大鼠肺組織中HA和LN水平較正常組明顯升高，且有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05），在艾灸治療35天后艾灸組HA和LN水平均低于模型組；模型組大鼠肺組織COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量隨著時間的推移大致呈升高的趨勢。與正常組相比，模型7天組大鼠肺組織COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量均明顯升高；與模型組相比，艾灸組、潑尼松治療組在11天和35天治療階段大鼠肺組織COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量降低，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組、艾灸

12、組相同時間點MMP-2和MMP-9的mRNA表達趨勢大致相同。艾灸組MMP-2和MMP-9的mRNA含量較同期模型組低。11天和23天時，同期模型組MMP-9的mRNA表達量比艾灸組高，均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組TIMP-1和TIMP-2mRNA表達量從7天起持續(xù)升高至23天達到最高，與正常組比較差異顯著。模型組TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達量較艾灸組高，艾灸和潑尼松11天治療組TIMP-1mRNA表達量與模型組比