白介素22融合蛋白對伴有基礎肝損傷小鼠部分肝切除術后肝再生的影響.pdf

1、背景原發(fā)性肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是當今世界最常見的惡性腫瘤之一，手術仍被認為是目前最為有效的治療手段。肝臟再生不足和缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion injury, IRI）是部分肝臟切除手術（Partial hepatectomy, PHx）術后面臨的兩大難題，多數患者由于伴有基礎肝臟疾病或病變范圍過大，如若手術，則術后極有可能因為肝臟再生不足而誘發(fā)急性肝衰竭，造成病

2、人死亡。盡管白細胞介素22（Interleukin22, IL-22）對于肝臟的保護作用及對正常小鼠單純PHx術后肝臟再生的促進作用已被發(fā)現，目前仍缺少IL-22對伴有基礎肝病的小鼠PHx術后肝臟再生作用的研究數據。另外，之前的研究者所使用的IL-22多為常規(guī)重組人白介素22蛋白（Recombinant human interleukin22, rh-IL-22）,而對于作用時間更長、分子量更大的白介素22融合蛋白（Interleuki

3、n22 fusion protein, IL-22-FP）對肝臟保護及肝再生作用的研究甚少。為了更加真實的模擬臨床病人的實際情況，進一步研究IL-22-FP對肝臟再生的作用，設計了本論文實驗，探討IL-22-FP對伴有基礎肝病的小鼠PHx術后肝臟的保護作用及肝再生的促進作用，同時探究IL-22-FP對小鼠肝臟缺血再灌注（IR）損傷的保護作用，為擴大PHx手術適應癥，減少手術患者術后死亡率提供數據支持。
　　目的：研究IL-22-F

4、P對伴有基礎肝病小鼠PHx術后肝臟的保護及肝再生的作用及其機制。
　　方法：
　　1.應用刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）、四氯化碳（Carbon tetrachloride，CCl4）等化學物質制造小鼠基礎肝損傷模型，在此基礎上行2/3PHx手術，術前30min靜脈給予IL-22-FP（125μg/kg）或者等量對照（PBS）治療。ConA模型小鼠隨機分為以下幾組：1.單一ConA損傷組：ConA組；2

5、.單一PHx手術組：PHx組；3.ConA損傷加PHx手術組：ConA+PHx組；4.ConA損傷加PHx手術加IL-22-FP治療組：ConA+PHx+IL-22-FP組。CCl4模型小鼠同樣的方法分為以下4組：1.CCl4組(單一CCl4損傷組)；2.PHx組(單一PHx手術組)；3.CCl4+PHx組(CCl4損傷加PHx手術組)；4.CCl4+PHx+IL-22-FP組(CCl4損傷加PHx手術加IL-22-FP治療組)。術后不

6、同時間點（32h,40h,48h,1w）過量麻醉法處死小鼠，獲取小鼠血清和肝臟組織用于后續(xù)研究。
　　2.通過阻斷小鼠部分肝葉血流（70%），90 min后恢復血流，制造小鼠肝臟IRI模型，術前30min靜脈給予IL-22-FP（125μg/kg）或者等量對照（PBS）治療，再灌注后不同時間點（6h,24h,48h）處死小鼠，獲取血清和肝臟組織樣本。IRI模型小鼠隨機分為4組，分別為：1.假手術組：Sham組；2.單一IRI手術組

7、：IRI組；3.IRI手術加普通白介素22(rh-IL-22)治療組：IRI+rh-IL-22組；4.IRI手術加白介素22融合蛋白治療組：IRI+IL-22-FP組。
　　3.應用全自動生化分析儀測定小鼠血清谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）水平，作為衡量肝臟損傷程度的指標之一。
　　4.取出固定于10%甲醛溶液中的部分小鼠肝臟組織，用于5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2,-deoxyuridine，BrdU

8、）染色。染色陽性細胞即為增殖的肝細胞，通過計算BrdU陽性率（BrdU+肝細胞數/肝細胞總數）來比較不同組別小鼠肝臟再生的水平。
　　5.部分肝組織樣本用于蘇木精-伊紅（Hematoxylin and eosin，HE）染色。通過染色，觀察肝臟組織壞死范圍、程度及炎性細胞浸潤情況，用以反應肝臟損傷的程度。
　　6.應用蛋白免疫印記技術（Western blot，WB）定量檢測不同組別小鼠肝臟組織中與肝臟再生相關蛋白如增殖細胞

9、核抗原（PCNA）、細胞周期蛋白(CyclinB1，CyclinD1)及信號轉導子及轉錄激活子3（Signal transducer and activator of transcription，STAT3）和p-STAT3蛋白的表達情況。
　　結果：
　　1.在ConA模型中，低劑量（42μg/kg, Low dose group）IL-22-FP治療組小鼠比中（125μg/kg, Middle dose group）、高

10、（375μg/kg, High dose group）劑量IL-22-FP治療組小鼠肝組織損傷更嚴重，血清ALT水平更高，BrdU陽性率更低。而中、高劑量組之間的這些差異并不明顯。
　　2. IL-22-FP能夠有效減輕ConA誘導的小鼠肝組織損傷，促進ConA模型小鼠PHx后的肝再生，其機制可能與激活的p-STAT3及誘導的PCNA、CyclinD1蛋白的表達有關
　　同常規(guī)重組IL-22治療組及其他手術組相比，IL-22

11、-FP治療組在PHx術后血清ALT及AST水平均顯著降低，炎癥細胞浸潤及肝組織壞死程度明顯減輕。術后不同時間點IL-22-FP治療組肝指數（肝臟重量/體重，LW/BW）及BrdU陽性率均明顯高于其他未治療組和常規(guī)重組IL-22治療組。WB結果發(fā)現，術后32h同其他組相比，IL-22-FP治療組小鼠肝組織p-STAT3、PCNA及CyclinD1蛋白的表達量也明顯升高。
　　3. IL-22-FP能夠顯著減輕CCl4導致的肝損傷，促

12、進CCl4模型小鼠PHx術后的肝再生，并誘導肝組織中p-STAT3、CyclinB1、CyclinD1及PCNA蛋白的表達
　　肝指數結果可見，術后32、40及48h，IL-22治療組小鼠肝指數水平明顯高于其他組；與肝指數類似的是，術后32、40及48h IL-22-FP治療組BrdU陽性率也顯著高于其他組，而術后1w時，各組均很難見到染色陽性細胞。WB結果顯示，IL-22-FP治療組術后肝臟組織p-STAT3、PCNA、Cycl

13、inD1及CyclinB1等蛋白表達量明顯多于其他未治療組，差異顯著。
　　4. IL-22FP能夠有效保護肝臟，顯著減輕肝臟缺血再灌注損傷
　　在IRI小鼠模型中，IL-22-FP治療組同rh-IL-22治療組及其他手術組相比在再灌注后24及48h血清AST水平顯著降低；HE染色切片可以看到在再灌注后48h IL-22-FP治療組小鼠肝組織缺血壞死范圍也較其他組更小。
　　結論：
　　1. IL-22-FP能夠