S型氯代甘油醇抗雄性大鼠生育作用研究.pdf

1、氯代甘油醇,(a-chlorohydrin,ACH),化學(xué)名3-氯-1,2-丙二醇(3-mono-chloro-propane-1,2-diol,3-MCPD),ACH是一種重要化工原料,普通人群可通過(guò)食用受污染的食物或以樹(shù)脂生產(chǎn)的飲水暴露ACH。ACH被認(rèn)為是經(jīng)典的睪丸后毒物,短期低劑量經(jīng)口染毒ACH可致多種雄性動(dòng)物可逆性的不育。由于ACH抗雄性生育力作用環(huán)節(jié)及機(jī)制尚未闡明,故本研究以探察S-ACH抗雄性大鼠生育作用特點(diǎn)為切入點(diǎn),探討

2、S-ACH的抗生育作用環(huán)節(jié)及可能的相關(guān)機(jī)制。
　　 第一部分S型氯代甘油醇對(duì)雄性SD大鼠生殖能力的影響
　　 成年雄性SD大鼠40只,隨機(jī)分為4組,每組10只,對(duì)照組施以等體積雙蒸水,實(shí)驗(yàn)組分別經(jīng)口施予2.5,5.0,10.0mg/(kg·bw)S-ACH。持續(xù)52天染毒,染毒第10天起按雄:雌1:1合籠,連續(xù)合籠1周未發(fā)現(xiàn)交配則增添一只雌鼠合籠。交配成功后雌、雄鼠分開(kāi)飼養(yǎng),于交配后12-15天開(kāi)腹檢查雌鼠受孕狀況。停止

3、染毒14天后每組取5只雄鼠,按上述方法進(jìn)行交配試驗(yàn)2周。分別計(jì)算雄鼠交配指數(shù)和生育力指數(shù)。染毒52天后檢查睪丸生精能力和肝、腎、睪丸及附睪組織病理學(xué)變化,并觀察停止染毒4周后各項(xiàng)受損指標(biāo)的恢復(fù)情況。結(jié)果顯示,染毒10天后各劑量組雄鼠生育力指數(shù)均為0,交配指數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(p＞0.05)。停止染毒14天后,2.5mg/kg劑量組雄鼠生育力指數(shù)明顯恢復(fù),在5mg/kg和10mg/kg劑量組則部分恢復(fù),交配指數(shù)仍未受影響。各染毒劑量

4、組的睪丸生精能力與對(duì)照無(wú)顯著差異.肝、腎、睪丸組織病理學(xué)檢查均未見(jiàn)異常。在10mg/kg劑量組大鼠附睪發(fā)現(xiàn)輕度的間質(zhì)炎癥反應(yīng)。在5mg/kg和10mg/kg劑量組發(fā)現(xiàn)3例附睪精液囊腫。研究結(jié)果提示,S-ACH的作用靶點(diǎn)可能是發(fā)生后期的精細(xì)胞或處于成熟階段的附睪內(nèi)精子,附睪可能是S-ACH產(chǎn)生毒效應(yīng)的靶器官。
　　 第二部分S-型氯代甘油醇抗雄性大鼠生育的作用環(huán)節(jié)研究
　　 為探討S-型氯代甘油醇抗雄性大鼠生育的作用環(huán)節(jié).

5、本研究檢測(cè)S-ACH染毒對(duì)精子運(yùn)動(dòng)和超活化運(yùn)動(dòng)的影響。1.S-ACH對(duì)大鼠精子運(yùn)動(dòng)的影響。雄性SD大鼠40只,隨機(jī)分為4組,每組10只,采用灌胃染毒,對(duì)照組施以等體積雙蒸水,實(shí)驗(yàn)組分別施予2.5,5.0,10.0mg/(kg·bw)S-ACH,染毒持續(xù)52天。染毒期滿后每組留5只停止染毒,常規(guī)飼養(yǎng)4周.分別在染毒期滿后及停止染毒4周后每劑量組取3只雄鼠檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)。游出法收集大鼠附睪尾精子,移至支持大鼠精子獲能的IVF培養(yǎng)液中,調(diào)整精子

6、濃度為2X106個(gè)/ml.37℃,5％CO2孵育。采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析法(CASA)分別于孵育后的0.2,4,5h檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)和4h時(shí)精子超活化狀態(tài)。2.研究體外S-ACH染毒對(duì)精子受精的影響。用超排卵方法收集大鼠卵子,游出法收集雄鼠精子到IVF培養(yǎng)液,調(diào)整濃度為2x106精子/ml,平均分為4份,加入S-ACH.終濃度分別為0.0.1,1.0,10mM。分別取含各濃度ACH的精子懸液50μl到35mm玻璃培養(yǎng)皿.礦物油封蓋.將卵子平

7、均分配到4份染毒精子懸液中.37℃,5％CO2培養(yǎng)36h.鏡下觀察卵裂數(shù),計(jì)算受精率。結(jié)果顯示,S-ACH對(duì)精子運(yùn)動(dòng)影響與染毒劑量和孵育時(shí)間有關(guān),S-ACH可顯著抑制大鼠精子運(yùn)動(dòng)能力,其中VCL、VAP、VSL、ALH最為敏感,隨著染毒劑量增加,運(yùn)動(dòng)速率下降和運(yùn)動(dòng)方式均發(fā)生改變。在10.0mg/(kg-bw)S-ACH精子,隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)精子運(yùn)動(dòng)顯著下降。S-ACH可顯著降低大鼠精子體外獲能條件下超活化運(yùn)動(dòng)比例,其影響程度超過(guò)精子一般

8、運(yùn)動(dòng)能力改變。停止染毒后運(yùn)動(dòng)和超活化運(yùn)動(dòng)均可恢復(fù)。S-ACH體外染毒后,體外受精率隨劑量增大呈下降趨勢(shì)。
　　 第三部分S-型氯代甘油醇抗雄性SD大鼠生育的基礎(chǔ)研究
　　 為研究S-ACH抗雄性SD大鼠生育的基礎(chǔ),本研究檢測(cè)S-ACH染毒對(duì)大鼠精子GAPDS活性、ATP和S-ACH對(duì)蛋白酪氨酸磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。雄性SD大鼠40只,灌胃染毒0,2.5,5.0,10.0mg/(kg·bw)S-ACH52天,取5只停止

9、染毒,常規(guī)飼養(yǎng)4周。分別檢測(cè)染毒52天和停止染毒4周后大鼠附睪精子GAPDS活性和ATP水平。精子GAPDS活性通過(guò)檢測(cè)該酶催化產(chǎn)物的340nm吸光度變化率計(jì)算,化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行測(cè)定ATP含量。檢測(cè)獲能條件下體外染毒0,0.1,1.0,10mMS-ACH后精子酪氨酸磷酸化水平。結(jié)果顯示.S-ACH可顯著抑制大鼠精子GAPDS活性,GAPDS活性抑制和染毒劑量存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。停止染毒后酶活性可恢復(fù)。染毒后ATP水平無(wú)顯著改變。染毒