dFV-ePD1融合蛋白制備及其抑制小鼠黑色素瘤細胞生長與遷移的實驗研究.pdf

1、目的：
　　惡性腫瘤逃避機體免疫監(jiān)視和產(chǎn)生免疫耐受的重要原因之一，是腫瘤細胞能抑制腫瘤微環(huán)境中免疫殺傷細胞的功能。PD-1是主要表達于腫瘤浸潤性淋巴細胞CTL表面的免疫抑制性受體，它與表達于腫瘤細胞表面的配體PD-L1結(jié)合后，將誘導(dǎo)CTL分泌免疫抑制性細胞因子并導(dǎo)致其發(fā)生凋亡，由此失去殺傷腫瘤的作用。此外，明膠酶作為腫瘤細胞分泌的特異性蛋白水解酶，能夠降解細胞外基質(zhì)和內(nèi)皮下基底膜，促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，若能同時阻斷PD-1/P

2、D-L1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并抑制明膠酶活性，可望能更有效地抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究的目的是設(shè)計和制備一種融合蛋白dFV-ePD1，它由能抑制明膠酶活性的單鏈抗體的可變區(qū)片段ScFV和能阻斷PD-1/PD-L1相互作用的PD-1胞外段連接而成，隨后測定融合蛋白dFV-ePD1對小鼠黑色素瘤細胞B16-F1的靶向結(jié)合能力及其對B16-F1生長和侵襲遷移的抑制作用。
　　方法：
　　利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)

3、/dFV-ePD1和pET30a(+)/dFV，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達菌后，IPTG誘導(dǎo)帶有His-tag的目的重組蛋白（dFV-ePD1和dFV）表達并用鎳柱親和層析法純化。明膠酶譜法檢測復(fù)性后的融合蛋白對明膠酶活性的抑制作用，細胞免疫熒光和免疫組化法分別檢測重組蛋白與黑色素瘤細胞及臨床組織芯片黑色素瘤組織的結(jié)合能力；流式細胞術(shù)分析重組蛋白對黑色素瘤的親和力；MTT、細胞劃痕實驗和Transwell分別檢測重組融合蛋白對小鼠黑色素瘤細

4、胞體外增殖和侵襲遷移的抑制作用。
　　結(jié)果：
　?。?）成功構(gòu)建pET30a(+)/dFV-ePD1和pET30a(+)/dFV原核表達質(zhì)粒，并在E.coli中表達和純化出融合蛋白；
　?。?）復(fù)性后的融合蛋白dFV-ePD1能抑制明膠酶活性，其對明膠酶的抑制作用隨蛋白濃度升高而增強；
　?。?）dFV-ePD1融合蛋白對小鼠黑色素瘤細胞和人黑色素瘤組織芯片均有較高的結(jié)合活性；
　　（4）dFV-ePD1融