大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠黑色素瘤影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:惡性黑色素瘤(malignantmelanoma,MM)來(lái)源于黑色素細(xì)胞，是一種惡性程度較高的具有黑色素細(xì)胞分化的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的1％～2％，大部分發(fā)生于皮膚[1-2]，其次為直腸、肛門(mén)、生殖道、消化道、鼻竇、喉、肺等，也可發(fā)生于脈絡(luò)膜及軟腦膜處[3-5]。惡性黑色素瘤占皮膚腫瘤的7％～20％，近年來(lái)其發(fā)生率呈明顯增高趨勢(shì)。與黑色素瘤發(fā)生的相關(guān)因素有遺傳、紫外線、色素痣等。因惡性黑色素瘤病理組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)形態(tài)的多樣性，部

2、分腫瘤不含黑色素，容易誤診和漏珍。目前的治療方法常采用手術(shù)、生物、放療及化療，但效果不甚理想。因此尋求療效好、副作用小的治療方法是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)最早從骨髓中分離發(fā)現(xiàn)的，具有塑料貼壁性，呈纖維狀，能夠在體內(nèi)外分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞，也可向其它生殖系統(tǒng)分化。由于MSCs具有多潛能的分化特性，最早是用來(lái)修復(fù)組織。近年來(lái)研究表明，它還具有抗增殖和

3、抗炎癥的作用，同時(shí)還具有很好的遷移能力和腫瘤趨向性。在腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞及其周圍的纖維基質(zhì)可分泌各種細(xì)胞因子，能促進(jìn)MSCs向腫瘤部位遷移集聚、增殖分化，進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)。因此，關(guān)注和研究MSCs對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響，MSCs用于臨床抗腫瘤治療研究方面有著重要的作用。
　　 方法:
　　 1、用密度梯度離心法分離并純化大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并且將MSCs細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含青霉素10

4、0U/ml，含鏈霉素100U/ml，PH7.2）中，放入37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　 2、通過(guò)誘導(dǎo)，讓所得到的間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)向成骨細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，來(lái)驗(yàn)證其作為干細(xì)胞具有多向分化的潛能。
　　 3、將B16惡性黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含青霉素100U/ml，含鏈霉素100U/ml，PH7.2）中，放入37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　

5、4、黑色素瘤動(dòng)物模型的制備:將小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16向小鼠后肢皮下注射，制備黑色素瘤動(dòng)物模型。
　　 5、動(dòng)物模型制備完成后，隨機(jī)將小鼠分為A（對(duì)照組）、B（實(shí)驗(yàn)組）兩組，每組6只。
　　 6、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)A組小鼠注射生理鹽水，B組小鼠注射間充質(zhì)干細(xì)胞。讓小鼠自由進(jìn)食水，觀察并記錄腫瘤的生長(zhǎng)情況。
　　 7、間充質(zhì)干細(xì)胞移植兩周后將小鼠全部處死，取下A、B兩組小鼠的腫瘤，做常規(guī)組織病理檢查。
　　 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、分析運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、以密度梯度離心法分離純化的細(xì)胞，可逐步得到呈長(zhǎng)梭形放射狀排列的細(xì)胞。
　　 2、通過(guò)誘導(dǎo)，所得到的間充質(zhì)干細(xì)胞可以向成骨細(xì)胞以及神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。
　　 3、經(jīng)皮下注射小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的小鼠，1周后成瘤，2周時(shí)腫瘤明顯增大，小鼠活力正常。
　　 4、間充質(zhì)干細(xì)胞移植兩周后，小鼠活力正常，并將小鼠全部處死。A組小鼠部分腫瘤

7、組織的頂端出現(xiàn)不同程度的破潰。B組小鼠未見(jiàn)明顯異常。
　　 5、A組（對(duì)照組）小鼠腫瘤組織直徑平均長(zhǎng)度0.28cm，平均寬度0.18cm，平均濕重0.65g;B組（實(shí)驗(yàn)組）小鼠皮下脂肪基本消失，腫瘤直徑長(zhǎng)度平均直徑2.35cm，平均寬度0.71cm;平均濕重7.90g，部分腫瘤組織的頂端出現(xiàn)不同程度的破潰及出血。
　　 6、A組（對(duì)照組）顯微鏡下觀察:大部分、真皮的結(jié)構(gòu)正常，大量腫瘤細(xì)胞已侵襲真皮以下組織。腫瘤細(xì)胞大小不

8、一，較大，染色深，呈紫黑色，可見(jiàn)較多核分裂。部分區(qū)域腫瘤組織密集排列，有成巢傾向，其周圍可見(jiàn)纖維組織間隔，血管分布少，腫瘤細(xì)胞呈多角形;部分腫瘤組織呈彌漫性分布，腫瘤間質(zhì)少，血管豐富，腫瘤細(xì)胞較大，呈圓心或橢圓形。腫瘤組織間血管豐富，管腔擴(kuò)張，內(nèi)充滿紅細(xì)胞，腫瘤組織密集排列區(qū)域，部分腫瘤細(xì)胞已侵入血管壁，管壁破壞，進(jìn)入管腔內(nèi)。間質(zhì)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞，有脂肪壞死。B（實(shí)驗(yàn)組）組顯微鏡下觀察:腫瘤組織已侵入表皮下，接近基底膜帶

9、，核分裂象多見(jiàn)。腫瘤組織間血管數(shù)量明顯增多，血管直徑明顯增大。炎細(xì)胞與A組（對(duì)照組）相比可見(jiàn)淋巴細(xì)胞（較多）、中性粒細(xì)胞（中量）、漿細(xì)胞（少）?？梢?jiàn)較多脂肪壞死。
　　 7、B組小鼠腫瘤平均重量7.90g、腫瘤平均體積0.659mm3，與A組小鼠腫瘤平均重量0.65g、腫瘤平均體積0.009mm3相比有明顯差異，統(tǒng)計(jì)分析P＜0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、腫瘤體積明顯增大，重量明顯增加，MS