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1、目的:監(jiān)測(cè)黑色素瘤荷瘤小鼠脾臟T細(xì)胞亞群隨時(shí)間的數(shù)量變化,可為評(píng)估臨床腫瘤患者的免疫狀態(tài)、判斷腫瘤復(fù)發(fā)、病人預(yù)后、以及臨床療效提供依據(jù),評(píng)估預(yù)后有重要的臨床意義。
方法:從120只條件均等的健康小鼠中選出6只正常小鼠作為基礎(chǔ)值測(cè)定,其余114只小鼠隨機(jī)平分為2組,荷瘤組(A組,57只)和空白(PBS)組(B組,57只)。于發(fā)現(xiàn)出瘤當(dāng)天(D0),從A組隨機(jī)選取5只測(cè)量并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。對(duì)于A組剩余小鼠和B組小鼠,自D0當(dāng)日
2、(含D0)開始,每隔5天各隨機(jī)選出6只小鼠處死、取脾,制備單細(xì)胞懸液,行流式細(xì)胞(FACS)檢測(cè),確定CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T細(xì)胞在脾淋巴細(xì)胞懸液中所占比例,及CD4+T/CD8+T比值,直至荷瘤曲線觀測(cè)組小鼠或A組剩余小鼠中出現(xiàn)半數(shù)以上死亡時(shí)結(jié)束觀察。
結(jié)果:
1CD3+T淋巴細(xì)胞所占比例的動(dòng)態(tài)變化:①空白組與荷瘤組相比,在D0(U=4.500P<0.05)、D5(U=0.000P<0.0
3、5)、D10(U=0.000P<0.05)、D15(U=0.000P<0.05)、D20(U=0.000P<0.05)、D25(U=0.000P<0.05)之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明CD3+T的數(shù)量隨荷瘤天數(shù)的延長(zhǎng),空白組明顯高于荷瘤組;②空白組內(nèi),正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=4.960P=0.001),其中正常小鼠、D0、D5、D10、D15分別與D20、D25有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)
4、,正常、D0、D5、D10、D15相互之間,D20與D25之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05),表現(xiàn)CD3+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量在D0和D15之間基本不變,為64.7,D15之后CD3+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量隨時(shí)間呈下降趨勢(shì),以17.6%的下降率降為D25時(shí)的53.4。③荷瘤組內(nèi),正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25相互之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=3397.196P<0.05),其中任何兩者之間均有差異(P<0.05),表現(xiàn)CD3+T淋
5、巴細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間呈下降趨勢(shì),由D0時(shí)的61.6,降為D25時(shí)的7.9,下降率為87.2%。
2CD4+T淋巴細(xì)胞所占比例的動(dòng)態(tài)變化:①空白組與荷瘤組相比,于D0時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-0.036P=0.972),D5、D10、D15、D20、D25均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-14.933P<0.05、U=0.000P<0.05、t=-37.860P<0.05、U=0.000P<0.05、U=0.000P<0.05),表明CD4+T
6、的數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng),空白組明顯高于荷瘤組;②空白組中,正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=3397.196P<0.05),其中正常小鼠、D0、D5、D10、D15與D20、D25分別相比,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異存在(P<0.05),D20、D25之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),正常、D0、D5、D10、D15之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05),提示CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量在D0和D15之間基本不變,為38.
7、7,D15之后才以27.9%的下降率降為D25時(shí)的27.9;③荷瘤組中,正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=160.370P<0.05),其中正常小鼠、D0分別與D5、D10、D15、D20、D25相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),正常小鼠與D0之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量在D0之后出現(xiàn)下降趨勢(shì),由D0時(shí)的38.9降為D25時(shí)的3.1,下降率為92.0%。
8、> 3CD8+T淋巴細(xì)胞所占比例的動(dòng)態(tài)變化:①空白組與荷瘤組相比,于D0時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.645P=0.533),D5、D10、D15、D20、D25差異顯著(U=3.000P<0.05、U=0.000P<0.05、t=-8.131P<0.05、t=-16.059P<0.05、U=3.000P<0.05),表明CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng),空白組明顯高于荷瘤組;②空白組中,不同時(shí)間的CD8+T的數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(F=
9、0.434P=0.851),表明隨時(shí)間延長(zhǎng),趨勢(shì)比較平穩(wěn),CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量由D0時(shí)的21.6降為D25時(shí)的20.5,下降率僅為5.1%。③荷瘤組中,正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=76.815P<0.05),其中正常小鼠、D0分別與D5、D10、D15、D20、D25相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),D5、D10分別與D15、D20、D25相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);正常、D0二者
10、之間、D5、D10二者之間、D15、D20、D25相互之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),表明CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng),呈下降趨勢(shì),且D25時(shí)為最低值,由D0時(shí)的22.2降為D25時(shí)的5.2,下降率為76.6%。
4CD4+T/CD8+T比值的變化:①空白組與荷瘤組相比,于D0時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(U=12.500P=0.363),D5、D10、D15、D20、D25差異顯著(U=0.000P<0.05、t=-16.97
11、1P<0.05、t=-16.483P<0.05、t=-12.562P<0.05、U=0.000P<0.05),說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng),空白組CD4+T/CD8+T比值明顯高于荷瘤組;②空白組中,正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=7.128P<0.05),其中正常小鼠、D0、D5、D10、D15之間分別與D20、D25相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),D20、D25相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),正常、D
12、0、D5、D10、D15之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05),說(shuō)明CD4+T/CD8+T比值在D0到D15的范圍內(nèi),保持1.8不變,從D15以后,該值以22.2%的下降率降為D25時(shí)的1.4;③荷瘤組中,正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25總的來(lái)說(shuō)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=97.348P<0.05),其中正常、D0分別與D5、D10、D15、D20、D25之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),正常小鼠與D0無(wú)顯著性差異(P>0.05
13、),D5、D10、D15、D20、D25之間差異不明顯(P>0.05),提示該比值逐漸下降,甚至倒置,從D0時(shí)的1.8降為D25時(shí)的0.6。
5初始T細(xì)胞所占比例動(dòng)態(tài)變化:①空白組與荷瘤組相比,于D0時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-0.200P=0.846),D5、D10、D15、D20、D25差異顯著(U=0.000P<0.05、U=0.000P<0.05、t=-18.543P<0.05、U=0.000P<0.05、U=0.000
14、P<0.05),可以認(rèn)為,初始T淋巴細(xì)胞的數(shù)量隨時(shí)間逐漸延長(zhǎng),空白組明顯高于荷瘤組;②空白組中,正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25之間存在差異(F=8.865P<0.05),其中正常、D0、D5、D10、D15分別與D20、D25相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),D20與D25相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),正常、D0、D5、D10、D15之間差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明初始T細(xì)胞的數(shù)量在D0和D15之間,由34
15、.1下降到32.2,下降率僅為+5.4%;該比例在D15至D25之間,由32.2減少為21.7,下降率為32.6%;③荷瘤組中,正常、D0、D5、D10、D15、D20、D25有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=178.995P<0.05),其中任何兩者之間均有差異(P<0.05),提示初始T淋巴細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間呈下降趨勢(shì),從D0時(shí)的34.1降為D25時(shí)的2.5,下降率為92.7%。
結(jié)論:
1荷瘤組小鼠,隨時(shí)間推移(D0到D2
16、5),其脾臟中CD3+T、CD4+T、CD8+T占脾淋巴細(xì)胞懸液百分率都呈下降趨勢(shì),且三者的下降幅度(下降率)排序?yàn)?CD4+T淋巴細(xì)胞>CD3+T淋巴細(xì)胞>CD8+T淋巴細(xì)胞;CD4+T/CD8+T下降趨勢(shì)明顯,表明黑色素腫瘤逐漸生長(zhǎng),小鼠的免疫功能逐漸下降;同時(shí),初始T細(xì)胞比例也大幅下降。
2空白組小鼠,隨時(shí)間推移(D0到D25),CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞占脾淋巴細(xì)胞懸液百分率都呈現(xiàn)先
17、保持相對(duì)穩(wěn)定后逐漸下降的趨勢(shì),D15為這些比例由穩(wěn)定跨向下降的轉(zhuǎn)折時(shí)間點(diǎn),三者后期(D15以后)的下降幅度(下降率)排序?yàn)?CD4+T淋巴細(xì)胞>CD3+T淋巴細(xì)胞>CD8+T淋巴細(xì)胞;CD4+T/CD8+T先保持相對(duì)穩(wěn)定,D15后呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì);同時(shí),初始T細(xì)胞比例也呈現(xiàn)先保持相對(duì)穩(wěn)定,D15后才大幅下降的趨勢(shì)。
3荷瘤組與空白組小鼠相比,二者的CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T細(xì)胞在脾淋巴細(xì)胞懸液中所占比例,
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