不同品種豬感染圓環(huán)病毒Ⅱ型后肺組織差異miRNA的鑒定及功能分析.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus type，PCV)是無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒的一種，包括豬圓環(huán)病毒Ⅰ型(PCV1)和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)兩個基因型，其中豬圓環(huán)病毒Ⅱ型具有強(qiáng)的致病性，能夠引起斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)等多種疾病，并可以引起豬體的免疫抑制，該病毒往往與其他病原混合或繼發(fā)感染，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失，嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。豬肺組織是PCV2感染的主要病發(fā)部位。miRNA作為一種

2、轉(zhuǎn)錄后水平上的基因調(diào)控因子，在動物的進(jìn)化過程中高度保守且具有表達(dá)的時空特異性，廣泛地參與抗病反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、激素分泌等多種生命過程。
　　萊蕪豬作為中國的地方豬種在抗病抗逆性等方面優(yōu)于西方豬種?，F(xiàn)今，miRNA的表達(dá)分析模式已經(jīng)在很多重要的豬病上有所報道，但是PCV2感染后miRNA表達(dá)變化仍未有報導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)建立了四個肺組織miRNA的表達(dá)文庫，分別為萊蕪豬對照組(Laiwu)，萊蕪豬PCV2感染組(Laiwu-i)，大

3、約克-長白豬對照組(YL)及大約克-長白豬感染組(YL-i)。隨后通過Solexa高通量測序及生物信息學(xué)分析的方法研究了感染后miRNA的表達(dá)豐度及差異表達(dá)情況。尋找到了282個已知和108個新發(fā)現(xiàn)的miRNA，并對這些miRNA進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　(1)感染PCV2后萊蕪豬與大約克-長白雜交豬miRNA表達(dá)變化分析。在總共測出的282個已知miRNA中發(fā)現(xiàn)了23個顯著差異表達(dá)的miRNA(P-value＜0.05，F(xiàn)old

4、-change=log2(實(shí)驗(yàn)組/對照組)＞1 or＜-1）。后續(xù)對5個表達(dá)豐度較高且變化幅度較大的miRNA進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證分析，發(fā)現(xiàn)這5個miRNA(miR-122，miR-192，miR-451，miR-486，miR-504)表達(dá)模式均與測序結(jié)果一致(p＜0.05)，表明測序結(jié)果是可信的。其中，miR-122，192，451，486均在攻毒后顯著性的上調(diào)表達(dá)，而miR-504則呈顯著性的下調(diào)表達(dá)。
　　(2)運(yùn)用D

5、IANA-mirPath分析了miR-122，192，451，486四個顯著上調(diào)表達(dá)的miRNA靶基因及通路富集情況。在分析的過程中發(fā)現(xiàn)，這四個miRNA的靶基因主要富集于Insulin signaling pathway，mTOR signaling pathway，Non-small cell lung cancer和Leukocyte transendothelial migration等與細(xì)胞增殖凋亡和疾病免疫等相關(guān)的信號通路。

6、在這四個miRNA預(yù)測的靶基因中進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)NFAT5與IGF1基因均可以靶向四個上調(diào)miRNA中的兩個以上，且參與著多個相關(guān)通路。NFAT5和IGF1基因的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，這兩個基因表達(dá)趨勢與上調(diào)的miRNA相反，呈顯著上調(diào)表達(dá)。
　　綜上所述，本研究通過miRNA高通量測序的方法，對中國地方豬種萊蕪豬和大約克-長白雜交豬感染PCV2后肺組織miRNA表達(dá)譜變化進(jìn)行分析，確定了豬PCV2感染相關(guān)的數(shù)個miRNA，并通