水稻抗黑條矮縮病相關miRNA鑒定及功能分析.pdf

1、水稻黑條矮縮病(RBSDV)是近年來我國華東稻區(qū)最為嚴重的水稻病毒病害，嚴重影響水稻產量的提高。利用植物自身抗性培育抗性品種是防治該病毒病的根本策略。RNA沉默機制是植物抵御病毒侵染的重要途徑，miRNA是其中關鍵性的負調控因子，廣泛調控植物基因表達，生長發(fā)育和逆境脅迫響應等各個生物途徑。本研究在篩選出的抗感RBSDV水稻品種的基礎上構建小RNA文庫，并通過高通量測序和生物信息學分析獲取在抗病和感病品種中脅迫相關水稻miRNA，并通過對

2、靶基因的預測和功能分析闡述miRNA在水稻接種病毒后對植株的生長發(fā)育以及抗病相關途徑的影響。
　　本研究通過人工接種鑒定方法鑒定90個水稻品種得到了相對抗病品種9311和感病品種日本晴，并以此為材料構建侵染前后抗感品種的莖稈及葉片小RNA文庫共8個。利用高通量測序與生物信息學分析篩選得到很多與水稻黑條矮縮病脅迫相關miRNA，結合Northem雜交、熒光定量等方法對部分miRNA及其靶基因進行表達檢測分析，得到主要結果如下:

3、>　　1.8個文庫獲得的小RNA序列總數(shù)在4795833～5697879之間，其中與水稻基因組匹配數(shù)在30.48％-45.97％之間。水稻黑條矮縮病脅迫后，樣本間miRNA差異表達莖稈和葉片全部下調的數(shù)目為38個，全部上調的數(shù)目為12個;9311上調Nip下調的數(shù)目為31個，9311下調Nip上調的數(shù)目為1個，葉片上調莖稈下調的數(shù)目為9個，葉片下調莖稈上調的數(shù)目為18個。
　　2.在表達顯著的miRNA中挑出14個差異表達顯著的m

4、iRNA，這些miRNA分別隸屬于14個miRNA家族。通過Northern雜交驗證試驗，得到miR156和miR168的雜交條帶，其中9311葉片在脅迫后miR156的表達量明顯增加，莖稈在脅迫后miR156的表達量增加，日本晴葉片在脅迫后miR156的表達量明顯減少，莖稈在脅迫后miR156的表達量增加。而miR168在脅迫后葉片和莖稈表達量沒有發(fā)生明顯變化。
　　3.對14個表達豐度高的miRNA中的13個miRNA所預測到

5、的18個靶基因進行qRT-PCR分析，結果挑選了9個表達水平大致與對應miRNA呈現(xiàn)相對應的負調控變化的靶基因。對這些miRNA進行分析發(fā)現(xiàn)，miR166d、miR444通過泛素途徑參與了蛋白質的修飾、降解和積累過程;miR164通過調控靶基因（轉錄因子）影響生長素梯度、側根的起始以及花瓣的數(shù)量;miR396d、miR160通過生長素響應途徑參與植物組織的生長與發(fā)育;miR171、miR172通過調控靶基因（轉錄因子）影響蛋白質的修飾、

6、降解和積累等過程。
　　4.對靶基因進行5'RACE驗證，驗證出miR396d靶基因OS06g-02560的剪切位點，和miR444b靶基因OS02g-36924的剪切位點。
　　本研究通過對RBSDV脅迫后miRNA的分離、鑒定、表達分析得到了一批在抗感水稻品種中差異表達的水稻miRNA，發(fā)現(xiàn)這些miRNA參與到水稻組織生長和發(fā)育途徑，這是首次報道與抗RBSDV相關的miRNA，為后續(xù)對植物抗病機制的認識和抗病品種的遺傳改