致倦庫(kù)蚊被武昌羅索線蟲感染后免疫基因差異表達(dá)及功能分析.pdf

1、蚊類是多種病原體和寄生蟲的傳播媒介，能引起瘧疾、登革熱和淋巴絲蟲病等嚴(yán)重傳染性疾病，屬于重要的公共衛(wèi)生害蟲。武昌羅索線蟲（Romanomermiswuchangensis）可感染并殺死十余種庫(kù)蚊及伊蚊幼蟲，是一種很有發(fā)展前景的生物滅蚊劑。其感染庫(kù)蚊后可引發(fā)宿主體內(nèi)包括模式識(shí)別受體（Pattern recognitionreceptors，PRRs）在內(nèi)的多種分子參與的一系列的免疫反應(yīng)。昆蟲通過(guò)PRRs識(shí)別和結(jié)合病原物的病原相關(guān)分子模式（

2、Pathogen-associated molecule patterns，PAMPs）來(lái)啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)。C型凝集素（C-type lectins，CTLs）作為一種重要的模式識(shí)別受體，在病原的識(shí)別和清除方面發(fā)揮著多種功能并扮演著重要角色。本研究對(duì)致倦庫(kù)蚊（Culex quinquefasciatus）被武昌羅索線蟲感染后的存活率進(jìn)行了分析;并通過(guò)熒光定量的方法分析了致倦庫(kù)蚊被武昌羅索線蟲感染后不同時(shí)期模式識(shí)別受體基因CTL12(C

3、-type lectin12)、PGRPLC(Peptidoglycan recognition protein LC)、PGRPLE(Peptidoglycan recognition protein LE)、PGRPS1(Peptidoglycan recognitionprotein S1)、PGRPS6(Peptidoglycan recognition protein S6)，TOLL信號(hào)通路基因TOLL9A、CA CT（Ca

4、ctus），IMD(Immune deficiency)信號(hào)通路基因IMD(Immunedeficiency)、RELIA(Relish1A),JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer andactivator transcription)信號(hào)通路基因DOME（Domeless）、HOP(Hopscotch)、STAT1A(Signal transducer and activator of tra

5、nscription1A)，凝結(jié)黑化途徑基因SRPN6(Serine proteinase inhibitor6)、CLIPC2(Clip-domain serine protease C2)，免疫效應(yīng)分子基因PPO2(Prophenoloxidase2)、PPO5（Prophenoloxidase5）、CECA2（Cecropin2），自噬途徑基因ATG5（Autophagy-related protein5）、ATG8（Autoph

6、agy-related protein8)等19個(gè)免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況;篩選出顯著下調(diào)表達(dá)的免疫基因CTL12，并對(duì)其進(jìn)行了蛋白原核表達(dá)和體外功能實(shí)驗(yàn)，初步探究了致倦庫(kù)蚊CqCTL12基因在其抵御細(xì)菌和線蟲感染的免疫反應(yīng)中的功能和作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.致倦庫(kù)蚊被武昌羅索線蟲感染后的存活率分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6天后感染組孑孓的存活率極顯著低于對(duì)照組(p＜0.001)，表明武昌羅索線蟲對(duì)致倦庫(kù)蚊具有較高的致死率。
　　2.致

7、倦庫(kù)蚊被線蟲感染后不同時(shí)期免疫基因的表達(dá)水平分析。結(jié)果表明:CTL12和PGRPLC在線蟲寄生的初期（2天、4天）呈顯著性下調(diào)表達(dá)(p＜0.05)，推測(cè)其可能在庫(kù)蚊抵御線蟲入侵的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用;而ATG5和ATG8在線蟲寄生的晚期（6天）呈顯著性上調(diào)表達(dá)(p＜0.05)，推測(cè)在線蟲寄生的后期庫(kù)蚊體內(nèi)可能出現(xiàn)了大量自噬現(xiàn)象。
　　3.CqCTL12和CqATG8基因的序列分析。結(jié)果顯示:CqCTL12基因包含486個(gè)核苷酸序列，

8、編碼162個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為16.04kDa，含有典型的CRD結(jié)構(gòu)域，其CRD結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)保守的半胱氨酸和1個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，在Ca+結(jié)合位點(diǎn)中含有一個(gè)可結(jié)合半乳糖的QLD基序和一個(gè)與Ca2+依賴活性相關(guān)的WND基序;CqATG8長(zhǎng)為357bp，編碼118個(gè)氨基酸，蛋白分子量為14.056kDa。
　　4.原核表達(dá)純化獲得重組蛋白rCqCTL12和rCqATG8。rCqCTL12對(duì)細(xì)菌的凝集實(shí)驗(yàn)表明: rCqCTL12能

9、顯著凝集革蘭氏陰性菌Escherichia coli和革蘭氏陽(yáng)性菌Staphylococcus aureus，具有典型的Ca2+依賴效應(yīng)。
　　5.rCqCTL12與武昌羅索線蟲感染期幼蟲的體外結(jié)合。實(shí)驗(yàn)表明:rCqCTL12能在體外與甲醛殺死的及活體狀態(tài)下的感染期幼線蟲結(jié)合，且這種結(jié)合與Ca+存在與否無(wú)關(guān)。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，包括CqCTL12在內(nèi)的致倦庫(kù)蚊多種免疫基因在抵御線蟲和細(xì)菌侵染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究結(jié)果