尿液來源大腸埃希菌對(duì)磷霉素耐藥性及其耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.分析2011年～2015年間溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床尿液標(biāo)本中分離的大腸埃希菌對(duì)磷霉素及其他抗菌藥物耐藥現(xiàn)狀，為臨床控制大腸埃希菌感染及其抗菌藥物的合理使用提供指導(dǎo)。
　　2.進(jìn)一步探討磷霉素耐藥大腸埃希菌耐藥機(jī)制及其流行特性，為合理使用磷霉素、預(yù)防耐藥菌的產(chǎn)生和播散、保護(hù)磷霉素敏感性提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.回顧性分析2011-2015年間溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床尿液標(biāo)本分離的

2、大腸埃希菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感性。瓊脂稀釋法檢測磷霉素的最低抑菌濃度（Mininal Inhibotory Concentrations,MIC）。
　　2.PCR法擴(kuò)增產(chǎn)ESBL大腸埃希菌菌株的ESBL基因型，比較不同ESBL基因型菌株對(duì)磷霉素的耐藥情況。
　　3.PCR法擴(kuò)增磷霉素耐藥fos基因:選取30株磷霉素耐藥菌株以及同期臨床分離的30株磷霉素敏感菌株進(jìn)行fosA、fosA3、fosB、fosB2、fosC、f

3、osC2、fosX基因檢測。
　　4.轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和靶酶相關(guān)基因檢測:分別對(duì)6株磷霉素耐藥fos基因陰性菌株、6株磷霉素敏感菌株、6株磷霉素耐藥且fos基因陽性菌株進(jìn)行murA、glpT、uhpT等基因檢測，數(shù)據(jù)庫比對(duì)其差異。
　　5.通過Southern雜交對(duì)磷霉素耐藥菌株進(jìn)行基因定位分析，以E.coli J53為受體菌，對(duì)磷霉素耐藥菌株進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，分析耐藥基因所在質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移特性。
　　6.脈沖場凝膠電泳(PF

4、GE)分析菌株間的同源性以及多位點(diǎn)序列分型(MLST)對(duì)菌株進(jìn)行分型研究，同時(shí)與美國疾病控制和預(yù)防中心網(wǎng)站（http://www.cdc.gov/pulsenet/protocols.htm）進(jìn)行比對(duì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.636株分離自臨床尿液標(biāo)本的大腸埃希菌中，ESBL陽性356株，占56.0％，ESBL陰性280株，占44.0％。藥敏結(jié)果顯示，分離株對(duì)頭孢替坦、碳青霉烯類、哌拉西林/他唑巴坦等少數(shù)抗菌藥物高度敏感，

5、敏感率在95％以上，對(duì)磷霉素的敏感性保持在95％左右;產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對(duì)大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBL菌株，其中產(chǎn)ESBL菌株磷霉素的耐藥率為6.7％，也明顯高于ESBL陰性菌株的2.1％。
　　2.產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的ESBL基因型主要為blaCTX-M型，其中blaCTX-M-1陽性率為54.2％，blaCTX-M-9陽性率為34.6％。blaCTX-M-1陽性組對(duì)磷霉素的敏感率為91.2％，blaCTX-M

6、-9陽性組對(duì)磷霉素的敏感率為95.1％，不同blaCTX-M型別與磷霉素耐藥率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p值為0.19）。
　　3.30株磷霉素耐藥菌株中24株fosA3基因陽性，陽性檢出率為80％，未檢測到其它fos基因。
　　4.6株磷霉素耐藥fos基因陰性菌株的murA、glpT、uhpT的測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株E.coli K-12進(jìn)行比對(duì)，其中DC1917、DC2091、DC25菌株中GlpT第297位上亮氨酸被苯

7、丙氨酸替換，DC1917和DC2091菌株中第28位上異亮氨酸被天冬氨酰替代，另外DC25、DC93中30位也發(fā)生了替換;所有菌株UhpT均未出現(xiàn)氨基酸替換現(xiàn)象;DC1848、DC726既不攜帶磷霉素修飾基因，也未發(fā)生靶酶、磷霉素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的突變。
　　5.30株磷霉素耐藥菌株為供體菌，J53為受體菌，得到的接合子通過藥敏、耐藥基因PCR以及質(zhì)粒提取等方法確認(rèn)，最終獲得14株磷霉素耐藥接合子。
　　6.Southern雜交結(jié)果

8、顯示，fosA3基因位于～54.2Kb大小的可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上。部分菌株存在兩個(gè)質(zhì)粒攜帶fosA3基因的現(xiàn)象。
　　7.PFGE結(jié)果顯示，fosA3陽性菌株之間同源性較低，MLST分型表明菌株ST分型較為分散，不存在克隆傳播的現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
　　1.尿液標(biāo)本分離的大腸埃希菌對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重，除對(duì)碳青霉烯類、哌拉西林/他巴唑坦等少數(shù)臨床常用抗菌藥物保持較高的敏感性外，對(duì)磷霉素也顯示較好的敏感性，敏感率達(dá)9