大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥性研究.pdf

1、背景:
　　喹諾酮類藥物是一大類人工合成的抗菌藥,自1962首次研制成功第一個喹諾酮類藥物—萘啶酸以來,該類藥物發(fā)展非常迅速。氟喹諾酮類藥物是新一代廣譜抗菌藥,已成為喹諾酮類藥物的主流。氟喹諾酮類藥物因具有抗菌譜廣、抗菌活性強、毒副作用較小、體內分布廣、給藥方便等優(yōu)點,已廣泛應用于醫(yī)學和獸醫(yī)學臨床。大腸埃希菌是重要的醫(yī)院感染病原菌,具有多種復雜的耐藥機制。隨著氟喹諾酮類藥物的普遍使用,尤其是臨床不合理用藥,造成大腸埃希菌對此類藥物

2、的耐藥株迅速增多,耐藥程度日趨嚴重。氟喹諾酮類耐藥成為臨床治療中的嚴重問題。大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制成為國內外廣泛關注的問題。
　　目前已知大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制有三種:
　　(1)基因突變導致藥物作用靶位酶—DNA促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ突變;
　　(2)基因突變導致藥物在菌體內的蓄積濃度下降;
　　(3)質粒介導的耐藥機制。其中第一種機制是大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的主要機制。了解本

3、地區(qū)、本單位大腸埃希菌對氟喹諾酮類耐藥性現(xiàn)狀,深入研究大腸埃希菌耐藥性的產生和傳播,準確檢測耐藥表型和基因型,對于控制耐藥性的產生和發(fā)展及醫(yī)院感染,合理應用抗菌藥物具有重要意義。
　　為此,本課題通過分析臨床大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù),并通過體外誘導實驗誘導出高度耐氟喹諾酮類的大腸埃希菌,檢測誘導耐藥株gyrA和parC基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance determining region,QRDR)

4、內的突變,深入研究大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性。
　　目的:
　　通過分析臨床大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù),了解臨床大腸埃希菌對氟喹諾酮類耐藥性特點;通過體外多步法誘導實驗,檢測誘導前后大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的敏感性及交叉耐藥性,檢測大腸埃希菌的超廣譜β-內酰胺酶(extendedspectrum beta lactamases,ESBLs)及產ESBLs大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的相關耐藥,為臨床合理使用氟喹諾酮類藥

5、物提供指導;通過研究大腸埃希菌Ⅱ型拓撲異構酶基因突變與其對氟喹諾酮類藥物耐藥性的關系,了解大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制。
　　方法:
　　用whonet5.4軟件統(tǒng)計2008年我院(河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院)臨床大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)。對臨床分離到的大腸埃希菌用Phoenix-100全自動細菌鑒定系統(tǒng)將其鑒定到種。用瓊脂稀釋法測定對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的最小抑菌濃度(minimal inhibitory

6、concentration,MIC)。依據(jù)鑒定和藥敏結果選擇37株大腸埃希菌作為實驗菌株,并編入環(huán)丙沙星誘導組(有菌株CE1-CE14共14株)、左氧氟沙星誘導組(有菌株LE1-LE11共11株)、加替沙星誘導組(有菌株GE1-GE12共12株)三個實驗組。同時用大腸埃希菌ATCC25922作為質控菌株。對實驗菌株分別進行多步法環(huán)丙沙星誘導性耐藥試驗(菌株CE1-CE14)、左氧氟沙星誘導性耐藥試驗(菌株LE1-LE11)和加替沙星誘導

7、性耐藥試驗(菌株GE1-GE12)。實驗步驟如下:用滅菌生理鹽水制備1×10~8CFU/ml的菌懸液,取10μl的菌懸液接種于2ml含1/4MIC抗菌藥物濃度的MH肉湯中,使其最終細菌接種量為5×10~5CFU/ml,35℃培養(yǎng)24h。挑選生長良好的24h細菌培養(yǎng)物,用滅菌生理鹽水稀釋制備1×10~8CFU/ml的菌懸液,取10μl的菌懸液接種于2ml含1/2MIC抗菌藥物濃度的MH肉湯中,35℃培養(yǎng)24h。如上步驟,通過連續(xù)轉種培養(yǎng),

8、藥物濃度自1/4MIC開始,逐步提高MH肉湯中藥物濃度直至含128倍MIC抗菌藥物濃度。將誘導出的耐藥菌接種在無抗菌藥物的MH肉湯中,35℃培養(yǎng),每24h轉種一次,連續(xù)培養(yǎng)5天。用紙片確證試驗測定臨床分離菌株和實驗菌株的ESBLs。對實驗菌株用瓊脂稀釋法測定氟喹諾酮類的MIC;用PCR法擴增gyrA、parC后測定DNA序列。
　　結果:
　　2008年臨床共分離菌株223株(排除重復菌株),其中ESBLs陽性菌株94株(陽

9、性率42.2％)。ESBLs陽性菌株對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的耐藥率分別為87.8％、84.9％、84％,ESBLs陰性菌株對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的耐藥率分別為71.2％、73％、72.3％。環(huán)丙沙星誘導組的14株實驗菌中有CE1-CE6、CE8-CE12、CE14共12株菌經過不斷增加藥物濃度的傳代培養(yǎng)后誘導出穩(wěn)定的高耐環(huán)丙沙星菌株。環(huán)丙沙星對誘導耐藥株的MIC為128-512μg/ml,與原株(MIC為0.016-

10、2μg/ml)比較,增加了128-32000倍。左氧氟沙星誘導組的11株實驗菌中有LE1、LE2、LE4、LE6、LE8、LE9、LE10共7株菌經過不斷增加藥物濃度的傳代培養(yǎng)后誘導出穩(wěn)定的高耐左氧氟沙星菌株。左氧氟沙星對誘導耐藥株的MIC為128-256μg/ml,與原株(MIC為2-4μg/ml)比較,增加了32-64倍。加替沙星誘導組的12株實驗菌中有GE3、GE5、GE8、GE9、GE11共5株菌經過不斷增加藥物濃度的傳代培養(yǎng)后

11、誘導出穩(wěn)定的高耐加替沙星菌株。加替沙星對誘導耐藥株的MIC為128-512μg/ml,與原株(MIC為2-4μg/ml)比較,增加了32-128倍。誘導出的高度耐藥株對氟喹諾酮類之間存在交叉耐藥性。誘導前后實驗菌株的ESBLs結果未改變。產ESBLs的大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物存在相關耐藥。對大腸埃希菌ATCC25922、敏感菌CE1及誘導耐藥菌株CE1I、CE6I、LE1I、LE2I、LE8I、GE3I、GE5I、GE8I,分別經PC

12、R擴增gyrA和parC。結果全部菌株均在擴增產物的電泳圖譜上出現(xiàn)了648bp的gyrA和417bp的parC條帶。經過對gyrA和parC基因進行測序。結果8株誘導耐藥株的gyrA基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)內的第83位的絲氨酸(TCG)均被亮氨酸(TTG)代替,第87位的天冬氨酸(GAC)均被天冬酰胺(AAC)代替。8株誘導耐藥株的parC基因QRDR內的第80位的絲氨酸(AGC)均被異亮氨酸(ATC)代替。大腸埃希菌ATCC