大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥性研究.pdf

1、背景:
　　喹諾酮類藥物是一大類人工合成的抗菌藥,自1962首次研制成功第一個喹諾酮類藥物—萘啶酸以來,該類藥物發(fā)展非常迅速。氟喹諾酮類藥物是新一代廣譜抗菌藥,已成為喹諾酮類藥物的主流。氟喹諾酮類藥物因具有抗菌譜廣、抗菌活性強、毒副作用較小、體內(nèi)分布廣、給藥方便等優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)臨床。大腸埃希菌是重要的醫(yī)院感染病原菌,具有多種復(fù)雜的耐藥機制。隨著氟喹諾酮類藥物的普遍使用,尤其是臨床不合理用藥,造成大腸埃希菌對此類藥物

2、的耐藥株迅速增多,耐藥程度日趨嚴重。氟喹諾酮類耐藥成為臨床治療中的嚴重問題。大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制成為國內(nèi)外廣泛關(guān)注的問題。
　　目前已知大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制有三種:
　　(1)基因突變導(dǎo)致藥物作用靶位酶—DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ突變;
　　(2)基因突變導(dǎo)致藥物在菌體內(nèi)的蓄積濃度下降;
　　(3)質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機制。其中第一種機制是大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的主要機制。了解本

3、地區(qū)、本單位大腸埃希菌對氟喹諾酮類耐藥性現(xiàn)狀,深入研究大腸埃希菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播,準(zhǔn)確檢測耐藥表型和基因型,對于控制耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展及醫(yī)院感染,合理應(yīng)用抗菌藥物具有重要意義。
　　為此,本課題通過分析臨床大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù),并通過體外誘導(dǎo)實驗誘導(dǎo)出高度耐氟喹諾酮類的大腸埃希菌,檢測誘導(dǎo)耐藥株gyrA和parC基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance determining region,QRDR)

4、內(nèi)的突變,深入研究大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性。
　　目的:
　　通過分析臨床大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù),了解臨床大腸埃希菌對氟喹諾酮類耐藥性特點;通過體外多步法誘導(dǎo)實驗,檢測誘導(dǎo)前后大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的敏感性及交叉耐藥性,檢測大腸埃希菌的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extendedspectrum beta lactamases,ESBLs)及產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的相關(guān)耐藥,為臨床合理使用氟喹諾酮類藥

5、物提供指導(dǎo);通過研究大腸埃希菌Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶基因突變與其對氟喹諾酮類藥物耐藥性的關(guān)系,了解大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制。
　　方法:
　　用whonet5.4軟件統(tǒng)計2008年我院(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)臨床大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)。對臨床分離到的大腸埃希菌用Phoenix-100全自動細菌鑒定系統(tǒng)將其鑒定到種。用瓊脂稀釋法測定對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的最小抑菌濃度(minimal inhibitory

6、concentration,MIC)。依據(jù)鑒定和藥敏結(jié)果選擇37株大腸埃希菌作為實驗菌株,并編入環(huán)丙沙星誘導(dǎo)組(有菌株CE1-CE14共14株)、左氧氟沙星誘導(dǎo)組(有菌株LE1-LE11共11株)、加替沙星誘導(dǎo)組(有菌株GE1-GE12共12株)三個實驗組。同時用大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。對實驗菌株分別進行多步法環(huán)丙沙星誘導(dǎo)性耐藥試驗(菌株CE1-CE14)、左氧氟沙星誘導(dǎo)性耐藥試驗(菌株LE1-LE11)和加替沙星誘導(dǎo)

7、性耐藥試驗(菌株GE1-GE12)。實驗步驟如下:用滅菌生理鹽水制備1×10~8CFU/ml的菌懸液,取10μl的菌懸液接種于2ml含1/4MIC抗菌藥物濃度的MH肉湯中,使其最終細菌接種量為5×10~5CFU/ml,35℃培養(yǎng)24h。挑選生長良好的24h細菌培養(yǎng)物,用滅菌生理鹽水稀釋制備1×10~8CFU/ml的菌懸液,取10μl的菌懸液接種于2ml含1/2MIC抗菌藥物濃度的MH肉湯中,35℃培養(yǎng)24h。如上步驟,通過連續(xù)轉(zhuǎn)種培養(yǎng),

8、藥物濃度自1/4MIC開始,逐步提高MH肉湯中藥物濃度直至含128倍MIC抗菌藥物濃度。將誘導(dǎo)出的耐藥菌接種在無抗菌藥物的MH肉湯中,35℃培養(yǎng),每24h轉(zhuǎn)種一次,連續(xù)培養(yǎng)5天。用紙片確證試驗測定臨床分離菌株和實驗菌株的ESBLs。對實驗菌株用瓊脂稀釋法測定氟喹諾酮類的MIC;用PCR法擴增gyrA、parC后測定DNA序列。
　　結(jié)果:
　　2008年臨床共分離菌株223株(排除重復(fù)菌株),其中ESBLs陽性菌株94株(陽

9、性率42.2％)。ESBLs陽性菌株對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的耐藥率分別為87.8％、84.9％、84％,ESBLs陰性菌株對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的耐藥率分別為71.2％、73％、72.3％。環(huán)丙沙星誘導(dǎo)組的14株實驗菌中有CE1-CE6、CE8-CE12、CE14共12株菌經(jīng)過不斷增加藥物濃度的傳代培養(yǎng)后誘導(dǎo)出穩(wěn)定的高耐環(huán)丙沙星菌株。環(huán)丙沙星對誘導(dǎo)耐藥株的MIC為128-512μg/ml,與原株(MIC為0.016-

10、2μg/ml)比較,增加了128-32000倍。左氧氟沙星誘導(dǎo)組的11株實驗菌中有LE1、LE2、LE4、LE6、LE8、LE9、LE10共7株菌經(jīng)過不斷增加藥物濃度的傳代培養(yǎng)后誘導(dǎo)出穩(wěn)定的高耐左氧氟沙星菌株。左氧氟沙星對誘導(dǎo)耐藥株的MIC為128-256μg/ml,與原株(MIC為2-4μg/ml)比較,增加了32-64倍。加替沙星誘導(dǎo)組的12株實驗菌中有GE3、GE5、GE8、GE9、GE11共5株菌經(jīng)過不斷增加藥物濃度的傳代培養(yǎng)后

11、誘導(dǎo)出穩(wěn)定的高耐加替沙星菌株。加替沙星對誘導(dǎo)耐藥株的MIC為128-512μg/ml,與原株(MIC為2-4μg/ml)比較,增加了32-128倍。誘導(dǎo)出的高度耐藥株對氟喹諾酮類之間存在交叉耐藥性。誘導(dǎo)前后實驗菌株的ESBLs結(jié)果未改變。產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物存在相關(guān)耐藥。對大腸埃希菌ATCC25922、敏感菌CE1及誘導(dǎo)耐藥菌株CE1I、CE6I、LE1I、LE2I、LE8I、GE3I、GE5I、GE8I,分別經(jīng)PC

12、R擴增gyrA和parC。結(jié)果全部菌株均在擴增產(chǎn)物的電泳圖譜上出現(xiàn)了648bp的gyrA和417bp的parC條帶。經(jīng)過對gyrA和parC基因進行測序。結(jié)果8株誘導(dǎo)耐藥株的gyrA基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)內(nèi)的第83位的絲氨酸(TCG)均被亮氨酸(TTG)代替,第87位的天冬氨酸(GAC)均被天冬酰胺(AAC)代替。8株誘導(dǎo)耐藥株的parC基因QRDR內(nèi)的第80位的絲氨酸(AGC)均被異亮氨酸(ATC)代替。大腸埃希菌ATCC