多梳家族蛋白PHC1在人多能干細胞基因組穩(wěn)定性中的作用研究.pdf

1、背景：再生醫(yī)學界領袖之一Richard.GOSS將再生、生命、死亡三者之間的關系解釋為:“如果沒有再生，就沒有生命，如果處處再生，就沒有死亡”，可見再生是個體存活維持組織功能的重要機制?；谌烁杉毎绕涫侨硕嗄芨杉毎?humanpluripotent stem cells，hPSCs)含人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)和人誘導多能干細胞(induced pluripotent stem c

2、ells，iPSCs)的再生醫(yī)學為發(fā)展個體化醫(yī)療帶來了前所未有機遇和前景。hPSCs具有在體外無限復制和向各種譜系細胞分化的潛能，為治療多個系統(tǒng)的退行性病變提供可能的種子細胞用于移植。但是hPSCs應用于臨床還存在很多瓶頸，例如研究表明體細胞重編程過程中過表達重編程因子后引起的DNA復制壓力和氧化自由基應激導致的DNA損傷可以破壞iPSCs的基因組產(chǎn)生基因突變，另一方面hPSCs在快速增殖過程中伴隨著由細胞代謝和DNA復制活躍產(chǎn)生的活性

3、氧自由基(ROS)也可以導致DNA損傷從而產(chǎn)生基因突變，移植攜帶基因突變的細胞到體內(nèi)后可能產(chǎn)生腫瘤。因此研究hPSCs如何維持基因組的穩(wěn)定性對于獲得更安全的hPSCs用于細胞治療十分重要。相比于體細胞DNA損傷修復的研究，關于hESCs和iPSCs如何維持基因組穩(wěn)定性的報道卻不多，目前的研究發(fā)現(xiàn)hPSCs維持基因組穩(wěn)定性的主要機制為:一.ESCs內(nèi)線粒體數(shù)量較低，同時ESCs主要通過不依賴于線粒體氧化磷酸化的糖酵解代謝方式獲得能量，因此

4、產(chǎn)生的ROS水平很低，另外ESCs高表達抗氧化相關基因，因此具備更強的抗ROS導致的DNA損傷能力;二.ESCs在DNA損傷時會發(fā)生分化和凋亡清除無法完成損傷DNA修復的細胞群體。本課題研究了多梳家族蛋白PHC1在hESCs基因組穩(wěn)定性維持中的作用。我們的研究結果顯示利用shRNA沉默PHC1的表達后可以降低NANOG的表達水平，提示PHC1可能參與hESCs的干性維持;進一步通過紫外輻射和阿霉素處理誘導DNA損傷后，敲降PHC1后的h

5、ESCs對DNA損傷更敏感。另外，以前的研究表明過表達重編程因子引起的DNA損傷反應是體細胞重編程的一個重要障礙。我們的結果顯示在人體細胞重編程過程中敲降PHC1的表達后引起細胞凋亡增加、周期阻滯，從而降低重編程的效率，提示PHC1參與了多能性形成過程中細胞的DNA損傷反應。
　　第一部分、PHC1在hESCs干性維持中的作用
　　目的:研究PHC1對于多能性維持的作用。
　　方法:利用qPCR和western blo

6、t檢測PHC1在hPSCs與分化細胞中的表達差異，構建PHC1 shRNA在hESCs中沉默PHC1基因表達后檢測多能性基因的表達變化。
　　結果:PHC1在hPSCs中的表達高度富集。成功構建了在HFF和hESCs中有良好敲降效果的PHC1 shRNA。hESCs中沉默PHC1基因表達后多能性基因OCT4和NANOG在轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯差異，但NANOG蛋白水平表達有一定降低。
　　結論:PHC1對于hESCs多能性維持具有

7、一定的作用。
　　第二部分、PHC1對于維持hESCs基因組穩(wěn)定性的作用
　　目的:建立誘導hESCs DNA損傷的模型，探索敲降PHC1后hESCs對DNA損傷修復的反應。
　　方法:沉默PHC1基因表達后，分別采用紫外(UV)輻射，阿霉素(Dox)處理誘導hESCs DNA損傷模型，檢測細胞凋亡水平變化細胞增殖情況。
　　結果:對比載體對照組，敲降PHC1可以造成hESCs基因組穩(wěn)定性下降，對DNA損傷敏感度

8、增加。
　　結論:PHC1對hESCs基因組穩(wěn)定性維持具有一定作用。
　　第三部分、PHC1在人體細胞重編程中的作用
　　目的:探討PHC1在過表達轉(zhuǎn)錄因子介導的體細胞重編程中的作用。
　　方法:建立利用慢病毒載體過表達OCT4，SOX2，KLF4，c-MYC重編程人成纖維細胞為iPSCs的體系，檢測沉默PHC1表達后對重編程效率的影響。
　　結果:重編程過程中沉默PHC1后引起細胞周期阻滯、細胞凋亡增加以