豬脂肪干細(xì)胞及其誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中circRNA表達(dá)譜解析.pdf

1、豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(pig induced pluripotent stem cells，piPSCs)具有與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)相似的特性，能夠進(jìn)行自我更新，并且分化形成多種類型的細(xì)胞，在畜牧學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物學(xué)基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域具有重要價(jià)值。然而，piPSCs目前仍然存在誘導(dǎo)效率低、質(zhì)量差等一系列問(wèn)題，歸根結(jié)底是對(duì)piPSCs多能性建立和維持、誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞重編程等機(jī)制缺乏足夠的了解。因此，對(duì)豬體細(xì)

2、胞重編程涉及到的表觀修飾、非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)等調(diào)控機(jī)制的研究已成為piPSCs的熱點(diǎn)之一。CircRNA作為一類新發(fā)現(xiàn)的特殊ncRNA，可參與到競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA間互作，且具有作為蛋白質(zhì)翻譯模板的功能，而關(guān)于circRNA在豬多能干細(xì)胞中的表達(dá)及其作用至今未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用RNA-seq技術(shù)對(duì)piPSCs和豬脂肪干細(xì)胞(pig adipose-derived stem cells，pADSCs)

3、中的circRNA表達(dá)譜進(jìn)行了發(fā)掘、鑒定與分析，旨在發(fā)現(xiàn)調(diào)控豬的細(xì)胞多能性的關(guān)鍵circRNA，以期為揭示circRNA在細(xì)胞多能性建立、維持方面發(fā)揮的潛在功能，提高piPSCs誘導(dǎo)效率和質(zhì)量提供理論參考。
　　(1)piPSCs和pADSCs測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序質(zhì)量與結(jié)果的初步分析。取三株piPSCs(C4-6/30/36)和三株pADSCs(pADSCs-2/3/4)，將多能性程度不同的兩種類型的干細(xì)胞各設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，成功

4、建立出piPSCs和pADSCs的circRNA文庫(kù)。測(cè)序結(jié)果顯示:在三株pADSCs中，ADSCs-2文庫(kù)測(cè)序得到46034204條原始序列(raw reads)，41360597條高質(zhì)量純凈序列（clean reads，占總序列數(shù)的89.8％）;ADSCs-3文庫(kù)測(cè)序獲得37048694條原始序列，32915704條高質(zhì)量純凈序列(占總序列的88.8％);ADSCs-4文庫(kù)測(cè)序獲得39056370條原始序列，35183381條高質(zhì)量

5、純凈序列（占總序列數(shù)的90.1％）。而在三株piPSCs中，C4-6文庫(kù)測(cè)序獲得40181317條原始序列，36990041條是高質(zhì)量純凈序列（占總序列數(shù)92.1％）;C4-30文庫(kù)測(cè)序獲得34200381條原始序列，32471150條為高質(zhì)量序列（占總序列數(shù)94.9％）;C4-36文庫(kù)測(cè)序得到54694359條原始序列，50352883條是高質(zhì)量序列（占總序列數(shù)92.1％）。將測(cè)序結(jié)果對(duì)比到基因組，發(fā)現(xiàn)各個(gè)文庫(kù)的circRNA在基因組

6、上的來(lái)源分布均勻，主要分布于內(nèi)含子，其次是外顯子、基因間區(qū)。另外，circRNA的長(zhǎng)度均處于100-20000nt不等，大多數(shù)circRNA趨向于分布在較短的長(zhǎng)度區(qū)間。
　　(2)piPSCs、pADSCs中circRNA的表達(dá)譜及差異表達(dá)情況。此次測(cè)序共鑒定到27005個(gè)新circRNA，其中在piPSCs與pADSCs中共同表達(dá)6983種circRNA，在piPSCs中特異性表達(dá)13138種circRNA，pADSCs中特異性

7、表達(dá)6884種circRNA。根據(jù)padj＜0.05的條件進(jìn)行篩選后，最終得到243個(gè)顯著性差異表達(dá)的circRNA，在piPSCs中上調(diào)表達(dá)的circRNA有88個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有155個(gè)。
　　(3)piPSCs、pADSCs中circRNA的KEGG及GO分析。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，iPSCs與ADSCs之間差異基因共富集到了137個(gè)信號(hào)通路，其中有22個(gè)信號(hào)通路顯著性富集(p＜0.05)并且有多條富集到多能性相關(guān)的通路。通過(guò)將差

8、異circRNA與KEGG富集通路對(duì)比發(fā)現(xiàn)，9個(gè)在piPSCs、pADSCs中顯著差異表達(dá)的circRNA富集于miRNA癌癥相關(guān)通路。這一結(jié)果暗示著circRNA與miRNA之間存在一定關(guān)聯(lián)性，并且可能參與到了癌癥的發(fā)生和細(xì)胞多能性的維持。GO分析結(jié)果表明，iPSCs與ADSCs之間的差異基因共富集了2356個(gè)生物過(guò)程功能團(tuán)，其中509個(gè)差異顯著(p＜0.05);386個(gè)分子功能功能團(tuán)，其中90個(gè)差異顯著;237個(gè)細(xì)胞組分功能團(tuán)，其中

9、28個(gè)差異顯著。
　　(4)高通量測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證。隨機(jī)選取10個(gè)circRNA轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)反向擴(kuò)增引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明，10個(gè)circRNA的PCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，說(shuō)明circRNA轉(zhuǎn)錄本測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)準(zhǔn)確。
　　總而言之，本研究首次揭示了piPSCs、pADSCs中circRNA的表達(dá)譜，新發(fā)現(xiàn)了大量circRNA，鑒定出多個(gè)可能與細(xì)胞多能性調(diào)控相關(guān)的潛在circRNA。本研究不僅有助于進(jìn)一步豐富