維甲酸相關(guān)基因HA117抗神經(jīng)元分化的初步研究.pdf

1、第一部分 HA117對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUMSCS)向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化過程的影響
　　目的：HA117是ATRA小劑量、多次刺激HL-60細(xì)胞株后通過抑制消減雜交及基因芯片等技術(shù)得到的一個多藥耐藥基因。前期課題組通過實驗研究及生物信息學(xué)分析，推測HA117可能是一個抗分化相關(guān)基因。因此，本研究目的是觀察HA117對hUMSCS向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化過程的影響。
　　方法：獲取3代hUMSCS，流式檢測細(xì)胞表面特異性抗原，通過

2、成骨、成脂定向分化檢測hUMSCS多向分化能力。然后，轉(zhuǎn)導(dǎo)HA117過表達(dá)慢病毒建立HA117過表達(dá)hUMSCS，流式測定轉(zhuǎn)染率，神經(jīng)元分化液培養(yǎng)誘導(dǎo)HA117過表達(dá)hUMSCS向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化，并設(shè)置空白對照組、陽性對照組及空載對照組，通過觀察各組分化時間，神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)及 Western、q-PCR、免疫熒光技術(shù)檢測各組定向誘導(dǎo)分化后神經(jīng)元標(biāo)志物的表達(dá)水平來評價各組神經(jīng)元樣細(xì)胞分化率。
　　結(jié)果：HA117過表達(dá)慢病毒

3、轉(zhuǎn)導(dǎo)hUMSCS的轉(zhuǎn)染率為68.9％，hUMSCS加入神經(jīng)元誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后，細(xì)胞體積變大，未發(fā)現(xiàn)明顯樹突及軸突，神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulin III、NSE和Nestin的 mRNA及蛋白在空白對照組中表達(dá)較少，甚至不表達(dá)，其表達(dá)水平在HA117組明顯低于陽性對照組及空載對照組，P<0.05，免疫熒光觀察到HA117組熒光明顯弱于陽性對照組及空載對照組，強(qiáng)于空白對照組。
　　結(jié)論：HA117在hUMSCS向神經(jīng)元定向分化過程中起到

4、抗分化作用。
　　第二部分 HA117及SHH通路在先天性巨結(jié)腸中的表達(dá)及意義
　　目的：研究HA117及SHH信號通路（SHH、Ptch1、Gli1）在先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung's disease，HSCR)中的表達(dá)情況，以探討其與HD發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系。
　　方法：收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2014-1015年經(jīng)手術(shù)確診為HSCR患者的巨結(jié)腸組織標(biāo)本30例，腸段分吻合段（正常對照組）、擴(kuò)張段和痙攣段（

5、實驗組），運(yùn)用實時熒光定量PCR(quantitative real—time PCR，qRT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)和免疫組織化學(xué)方法檢測HA117、SHH信號途徑在各段中的表達(dá)情況，對其進(jìn)行定量和定性并比較。
　　結(jié)果：Q-PCR結(jié)果提示：痙攣段HA117 mRNA表達(dá)水平為1.52±0.17，明顯高于吻合段（0.28±0.04），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。痙攣段SHH、Ptch1、Gli1

6、 mRNA表達(dá)水平分別為0.53±0.11、0.48±0.11、0.62±0.13，明顯低于吻合段（1.23±0.26、1.20±0.22、1.71±0.46），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Western-Blot結(jié)果提示: SHH、Ptch1、Gli1蛋白相對表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平一致，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；免疫組織化學(xué)(DAB染色)結(jié)果提示:痙攣段SHH、Ptch1、Gli1染色明顯弱于吻合段。