全反式維甲酸促人臍血多能干細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化.pdf

1、帕金森氏病是一種中老年常見神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，該病的病理生理過程主要為中腦黑質(zhì)區(qū)慢性進展的多巴胺神經(jīng)元變性、缺失。目前的治療措施多為改善癥狀，不能夠改善多巴胺神經(jīng)元的變性、缺失，因而無法延緩病情的進展。具有神經(jīng)分化潛能的干細胞可以通過移植替代變性、缺失的多巴胺神經(jīng)元，成為帕金森氏病治療的一種新的可以選擇的途徑。然而，選擇移植安全、有效、沒有倫理問題限制的干細胞來源，成為干細胞移植治療帕金森氏病需要進一步探討的問題。
　　 研究目的

2、:
　　 通過體外實驗探討在全反式維甲酸作用下，具有多向分化潛能、低免疫原性的人臍帶血多能干細胞CB-SCs(cord blood-stem cells)向多巴胺能神經(jīng)元的分化。
　　 研究方法:
　　 1.采集臍帶血樣本:告知并簽訂知情同意書后，采集濟南市中心醫(yī)院產(chǎn)科健康產(chǎn)婦臍帶血樣本10例。
　　 2.CB-SCs分離、培養(yǎng)及實驗分組:分離、培養(yǎng)臍帶血干細胞CB-SCs達到一定數(shù)量后，分為無血清培養(yǎng)基

3、對照組、神經(jīng)培養(yǎng)基對照組、誘導組:無血清培養(yǎng)基對照組使用原培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12～14d，神經(jīng)培養(yǎng)基對照組換用神經(jīng)培養(yǎng)基孵育12～14d，誘導組換用含有10μmol/L全反式維甲酸的神經(jīng)培養(yǎng)基孵育12～14d。
　　 3.Real-timePCR檢測:采用Real-timePCR技術檢測CB-SCs的多巴胺神經(jīng)元分化的、重要調(diào)控因子Nurr1、Wnt1、En1表達。
　　 4.免疫熒光化學檢測:將誘導組、神經(jīng)培養(yǎng)基對照組的細

4、胞固定、制作標本后，采用免疫熒光化學法檢測神經(jīng)元特異性標志物神經(jīng)核蛋白NeuN的表達，以及多巴胺神經(jīng)元特異性酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、多巴胺轉(zhuǎn)運體(dopamine transportor，DAT)的表達。
　　 5.ELISA檢測:使用含有56mmol/L鉀離子的Hank's平衡鹽溶液刺激CB-SCs分化來源的細胞去極化，收集誘導組和神經(jīng)培養(yǎng)基對照組細胞上清液，采用ELISA法檢測上清液中

5、多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的含量。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.人臍血干細胞CB-SCs表達Nurr1、Wnt1、En1基因未經(jīng)過任何基因修飾和處理，CB-SCs在mRNA水平自身表達多巴胺神經(jīng)元重要調(diào)控因子Nurr1、Wnt1、En1。
　　 2.全反式維甲酸促進CB-SCs分化呈現(xiàn)神經(jīng)細胞形態(tài)特點經(jīng)過10Iμmol/L全反式維甲酸的神經(jīng)培養(yǎng)基孵育12～14天后，大部分CB-SCs分化為神經(jīng)形態(tài)樣細胞;神經(jīng)培養(yǎng)基對照組僅少

6、量CB-SCs出現(xiàn)神經(jīng)樣分化;無血清培養(yǎng)基對照組CB-SCs繼續(xù)擴增并保持CB-SCs的形態(tài)學特點不變。
　　 3.分化的CB-SCs表達多巴胺神經(jīng)元標志物通過細胞免疫熒光化學檢測分析，誘導組70±7％細胞表達NeuN;48±11％的細胞表達TH;36±9％的細胞表達DAT。神經(jīng)培養(yǎng)基對照組僅有少量細胞表達TH和DAT，NeuN陽性細胞＜15％。
　　 4.分化的CB-SCs具有釋放多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的功能通過ELISA實驗

7、數(shù)據(jù)分析，經(jīng)過鉀離子刺激去極化誘導組細胞上清液中多巴胺含量大約為940±42pg/mL，較神經(jīng)培養(yǎng)基對照組明顯升高，P＜0.001;神經(jīng)培養(yǎng)基對照組僅有基礎量的多巴胺遞質(zhì)釋放，370±15pg/mL。
　　 結(jié)論:
　　 1.CB-SCs在基因水平表達多巴胺神經(jīng)元分化的重要調(diào)控因子Nurr1、Wnt1、En1，具有向多巴胺神經(jīng)元分化的潛能。
　　 2.全反式維甲酸可以促進CB-SCs較為高效地分化為多巴胺神經(jīng)元，