靈芝抗肝癌活性組分的篩選及其固體分散體的制備.pdf

1、近年來靈芝的抗腫瘤活性越來越多的被人們關(guān)注，靈芝水溶性提取物中多糖類組分能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，醇溶性提取物對腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用。本論文重點探討靈芝醇溶性組分（即總組分）的抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)，采用現(xiàn)代提取分離手段得到靈芝總組分，通過NaHCO3溶液將總組分分為酸性組分和中性組分，運用肝癌細(xì)胞和動物模型，進(jìn)行三個組分與藥效相關(guān)性的研究，結(jié)果顯示由酸性組分和中性組分有機(jī)配伍起來的總組分對肝癌生長抑制率最高，比單獨使用酸性組分或者中性組分抗肝癌效果

2、好；酸性組分和中性組分共同構(gòu)成靈芝抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)；其中中性組分體內(nèi)外抗肝癌作用均強(qiáng)于酸性組分，是靈芝抗肝癌的關(guān)鍵活性組分；并采用GC-MS、HPLC-MS分析酸性組分和中性組分內(nèi)部的一維結(jié)構(gòu)，為靈芝深層次開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，同時為靈芝制劑研究提供思路與方法。本論文研究組分的理化性質(zhì)后，將活性組分制成固體分散體，體內(nèi)藥效顯示抗腫瘤作用明顯提高。
　　 1．靈芝各組分體內(nèi)外抗肝癌作用
　　 (1)體外對人肝癌BEL-7402

3、細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性
　　 采用MTT法比較不同產(chǎn)地靈芝的抗腫瘤作用，各產(chǎn)地總組分均有較強(qiáng)增殖抑制作用，其中中性組分抗腫瘤作用均遠(yuǎn)大于相應(yīng)的酸性組分，且不同產(chǎn)地的酸性組分抗腫瘤作用變化較大，但不能因為酸性組分抑制率相對較弱就輕易將其從活性組分中剔除。浙江安吉縣產(chǎn)地靈芝總組分、中性組分和酸性組分對BEL-7402細(xì)胞增殖的抑制作用均最強(qiáng)，在給藥量為100μg·mL-1時，抑制率分別為94.06％、99.56％、60.72％。四個產(chǎn)地

4、中只有海南五指山產(chǎn)地靈芝的酸性組分未表現(xiàn)出細(xì)胞增殖抑制作用，此現(xiàn)象比較有趣，在100μg·mL-1時，其總組分抑制率為66.02％，中性組分的抑制率為85.18％，總組分表現(xiàn)出來的細(xì)胞增殖抑制作用主要是依賴中性組分，進(jìn)一步證實中性組分是總組分中抗腫瘤的核心組分。
　　 根據(jù)細(xì)胞篩選結(jié)果，確定后期實驗均以浙江安吉縣赤芝為原料進(jìn)行實驗研究，總組分含固量為28.08mg·g-1，酸性組分含固量為13.20mg·g-1，中性組分含閻量為

5、13.20mg·g-1，酸性組分和中性組分按含固量1：1組成總組分。赤芝總組分對人肝癌BEL-7402細(xì)胞的IC50為1.04mg生藥.mL-1，中性組分IC50為1.48mg生藥.mL-1，酸性組分IC50＞5mg生藥mL-1，同等生藥量下總組分的抗腫瘤效果優(yōu)于單獨使用中性組分。通過細(xì)胞流式檢測，發(fā)現(xiàn)隨著給藥濃度增大，三個組分均可使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，各組分表現(xiàn)出不同的細(xì)胞周期阻滯，總組分和中性組分使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，

6、酸性組分則使細(xì)胞出現(xiàn)期G1周期阻滯。
　　 (2)體內(nèi)對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤活性研究
　　 采用右腋皮下接種小鼠H22肝癌細(xì)胞，建立小鼠皮下移植性腫瘤模型，研究三個組分的體內(nèi)抗腫瘤作用，200mg·kg-1·d-1給藥8天后，總組分顯著抑制腋下瘤體的生長，抑瘤率分別為36.14％。同等生藥量下，即中性組分和酸性組分按100mg·kg-1·d-1給藥8天后，抑制率分別為28.02％和19.45％。將中性組分的給藥量提高一

7、倍即200mg·kg-1·d-1時，抑制率才達(dá)到33.08％，達(dá)到總組分的療效。酸性組分和中性組分共同構(gòu)成總組分的抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)，僅依靠其中的任一組分抗腫瘤效果會減弱。
　　 2．靈芝抗肝癌物質(zhì)基礎(chǔ)的研究
　　 選擇體內(nèi)外抗腫瘤效果較好的浙江產(chǎn)地赤芝考察提取工藝，引入綠色無污染的超臨界CO2萃取工藝(95％乙醇作為夾帶劑)取代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑回流提取工藝，含固量28.08±0.02mg·g-1，靈芝酸B含量0.363±0.0

8、05mg·g-1，麥角甾醇含量0.963±0.007mg·g-1。超臨界萃取時間縮短為1.5h，95％乙醇用量僅為藥材的3倍量，大大節(jié)省有機(jī)溶劑。
　　 將總組分劃分為中性組分和酸性組分，并對其用HPLC進(jìn)行表征，酸性成分集中在80min前出峰，中性組分極性偏小，集中在80min-140min山峰。不同產(chǎn)地靈芝性狀上差別很大，并對不同產(chǎn)地各組分進(jìn)行HPLC表征，產(chǎn)地不同酸性組分含量變化較大，海南靈芝中幾乎不含酸性組分，所以其酸性

9、組分無細(xì)胞增殖抑制作用。
　　 酸性組分HPLC-MS分析顯示含有大量三萜酸類成分；中性組分為抗腫瘤核心組分，對其進(jìn)行HPLC-MS和GC-MS分析后發(fā)現(xiàn)含有脂肪酸、甾醇類和三萜類成分，推測除三萜類，脂肪酸和甾醇類對中性組分的抗腫瘤作用可能有貢獻(xiàn)。
　　 3．靈芝有效組分固體分散體的初步研制
　　 對靈芝各組分理化性質(zhì)進(jìn)行研究，中性組分和酸性組分均在弱堿性環(huán)境中表觀溶解度略好，其值在100μg·mL-1-500μ

10、g·mL-1之間屬于極微溶解物質(zhì)。中性組分和酸性組分在水中的表觀油水分配系數(shù)logP分別為2.01和1.20，推測中性組分和酸性組分胃腸吸收好。水中溶解度低，膜透過性可以，藥物的溶出是吸收的限速過程，為了改善藥物的溶出本實驗考慮將靈芝活性組分制成固體分散體。
　　 通過體外溶出度篩選固體分散體的載體(PVPK30、Poloxamer188、PEG6000)及比例(1：1、1：4、1：6、1：9)，最終選擇靈芝總組分-PVPK30

11、(1：6)制備固體分散體?？偨M分、總組分-PVPK30物理混合物、總組分-PVPK30固體分散體(1：9)在60min時累積溶出度分別為15.74％、31.80％和97.23％。用X-射線衍射技術(shù)對總組分固體分散體進(jìn)行了表征，結(jié)果表明總組分以無定型狀態(tài)存在。動物移植瘤模型進(jìn)行固體分散體體內(nèi)藥效研究，總組分、中性組分和酸性組分(200mg·kg-1·d-1)制成固體分散體后抗腫瘤作用均比對應(yīng)的混懸液顯著增強(qiáng)，總組分固體分散體抑制率為57.