Resveratrol調(diào)控AMPK-SIRT1通路去乙酰化LC3對MPTP帕金森病小鼠的保護(hù)作用及機制研究.pdf

1、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病。目前 PD的治療措施主要是多巴胺（dopamine，DA）替代療法，只能緩解患者臨床癥狀，尚缺乏安全有效的延緩或改變PD病程進(jìn)展的神經(jīng)保護(hù)治療措施。研究表明，?-synuclein錯誤折疊、異常積聚導(dǎo)致的DA能神經(jīng)元細(xì)胞功能紊亂是 PD神經(jīng)細(xì)胞變性死亡的主要機制。通過誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)錯誤折疊或異常積聚的?-synuclein蛋白清除，可能有希望延緩

2、或改變PD的病程進(jìn)展。
　　白藜蘆醇（resveratrol，RV）是一種非黃酮類天然多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、保護(hù)心腦血管等多種生物活性，且較易透過血－腦屏障進(jìn)入腦組織。最近有研究證實，RV可能對6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）導(dǎo)致

3、的DA能神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，RV能減輕線粒體神經(jīng)毒素魚藤酮導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，能降低?-synuclein過表達(dá)PC12細(xì)胞內(nèi)?-synuclein的沉積，并且RV發(fā)揮上述作用可能與激活沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1（silent information regulation2 homolog1，SIRT1）有關(guān)。為深入探討RV在活體內(nèi)的作用效果和途徑，我們建立MPTP亞急性PD小鼠模型，用RV灌胃、SIRT1

4、特異性抑制劑EX527腹腔注射進(jìn)行干預(yù)，在MPTP造模前及造模后的不同時間點進(jìn)行行為學(xué)測試（包括開場試驗、足跡試驗和爬桿試驗）檢測其行為學(xué)改變，利用高效液相色譜電化學(xué)法(high performance liquid chromatography with electrochemical detection，HPLC-ED)檢測DA及其代謝產(chǎn)物變化，采用免疫熒光技術(shù)、western blot技術(shù)及蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測相關(guān)蛋白表達(dá)變化

5、。從行為學(xué)改善和對黑質(zhì)紋狀體多巴胺系統(tǒng)的保護(hù)作用兩個角度觀察RV對PD小鼠的保護(hù)作用，證實其有保護(hù)作用后，再對其可能的作用機制進(jìn)行探索。本課題主要從以下兩個部分展開：
　　第一部分，白藜蘆醇調(diào)控 AMPK-SIRT1通路對 MPTP帕金森病小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用研究。我們發(fā)現(xiàn)，RV可以顯著改善 MPTP小鼠的行為學(xué)損傷、DA水平下降、黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元丟失及紋狀體區(qū)TH蛋白表達(dá)減少。為了探索RV發(fā)揮保護(hù)作用的可能機制，我們在給予RV

6、灌胃時，同時腹腔注射SIRT1特異性抑制劑EX527。我們發(fā)現(xiàn)，給予RV后，小鼠黑質(zhì)區(qū)SIRT1免疫熒光及紋狀體區(qū)SIRT1蛋白表達(dá)均較MPTP組顯著升高，同時p-AMPK蛋白表達(dá)較MPTP組亦顯著升高。而給予EX527后，小鼠黑質(zhì)區(qū)SIRT1免疫熒光及紋狀體區(qū)SIRT1蛋白表達(dá)較RV+MPTP組顯著下降，伴隨著p-AMPK含量較RV+MPTP組顯著降低。同時，在給予EX527后，小鼠的行為學(xué)、DA水平、黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元及紋狀體區(qū)T

7、H蛋白較RV+MPTP組顯著下降。提示RV對MPTP帕金森病小鼠的保護(hù)作用可能是通過激活SIRT1，進(jìn)而激活A(yù)MPK而獲得。而我們前期的細(xì)胞實驗抑制AMPK磷酸化后，抑制了SIRT1活性。共同說明SIRT1與AMPK存在相互調(diào)控關(guān)系，且這種相互調(diào)控關(guān)系可能介導(dǎo)了RV對MPTP小鼠DA能神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用。通過以上實驗，我們證明RV可能通過激活A(yù)MPK-SIRT1信號通路，SIRT1與AMPK相互調(diào)控，改善了MPTP小鼠行為學(xué)損傷，減輕

8、了MPTP小鼠DA水平下降，減少了黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元丟失及紋狀體區(qū)TH蛋白減少。
　　第二部分，SIRT1去乙酰化LC3介導(dǎo)的自噬在?-synuclein降解中的作用。我們首先利用western blot技術(shù)檢測LC3-II、p62等自噬標(biāo)志蛋白及?-synuclein，并采用免疫熒光雙標(biāo)共定位p62和?-synuclein。我們發(fā)現(xiàn)在 MPTP組，SIRT1水平較對照組顯著降低，伴隨著 p62和?-synuclein共同積聚在

9、胞漿中；而當(dāng)給予RV激活SIRT1后，LC3-II水平升高，共同積聚在細(xì)胞內(nèi)的p62和?-synuclein較MPTP組顯著減少；當(dāng)同時給予SIRT1特異性抑制劑EX527后，SIRT1水平下降，此時，LC3-II水平較RV+MPTP組顯著下降，與此同時，p62和?-synuclein共同積聚在胞漿。該實驗結(jié)果與我們課題組的前期細(xì)胞實驗共同證實RV激活 SIRT1后，SIRT1可通過進(jìn)一步誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)?-synuclein降解，進(jìn)而減

10、輕MPTP小鼠病理學(xué)損害和行為學(xué)損傷。為了進(jìn)一步探索SIRT1對自噬的可能調(diào)控機制，我們采用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測LC3乙?；郊懊庖邿晒怆p標(biāo)?-synuclein和LC3觀察兩者相對亞細(xì)胞定位。我們發(fā)現(xiàn)，MPTP小鼠中SIRT1表達(dá)較對照組小鼠顯著下降后，LC3乙酰化水平較對照組顯著升高，與此同時，LC3主要表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)，伴隨著?-synuclein積聚在胞漿內(nèi)。當(dāng)給予小鼠 RV后，SIRT1表達(dá)較MPTP組顯著升高，LC3乙酰

11、化水平較MPTP組顯著下降，與此同時，LC3主要表達(dá)在胞漿中，積聚在胞漿內(nèi)的?-synuclein被大量降解。給予 SIRT1特異性抑制劑 EX527后，我們觀察到 LC3乙?；捷^RV+MPTP組顯著升高，而與此同時，與MPTP組類似，LC3主要表達(dá)在胞核，伴隨著?-synuclein積聚在胞漿內(nèi)。通過以上實驗，我們證實，SIRT1可能通過去乙酰化LC3，可以使LC3從胞核轉(zhuǎn)運至胞漿，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬，是RV對MPTP帕金森病小鼠發(fā)揮保