人B7-H4受體及其抗體的檢測和研究.pdf

1、B7-H4又稱為B7x或B7S1，是近來發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員，在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起著重要的負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。B7-H4的mRNA廣泛表達(dá)于人的外周組織，包括胎盤、肝臟、骨骼肌、腎臟等，而B7-H4蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)是受限的。研究發(fā)現(xiàn)B7-H4在多種腫瘤組織中表達(dá)，包括肺癌、卵巢癌、胃癌等，其被認(rèn)為是一種腫瘤標(biāo)志物，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前，B7-H4受體尚未被克隆，Sica等通過構(gòu)建B7-H4.Ig融合蛋白，采用流式細(xì)胞技術(shù)

2、分離健康人新鮮T淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)B7-H4.Ig不能與其結(jié)合，但經(jīng)過體外活化刺激后約有20％-30%的結(jié)合，證實(shí)在活化T細(xì)胞上有B7-H4受體的表達(dá)。目前雖不清楚B7-H4與活化T細(xì)胞上B7-H4受體是如何相互作用改變信號(hào)通路下調(diào)T細(xì)胞的活化、增殖與細(xì)胞因子的分泌，但已有文獻(xiàn)報(bào)道，B7-H4分子與其受體結(jié)合后可抑制ERK、JNK、p38、AKT等分子活性，進(jìn)而影響T細(xì)胞的活化。
　　本科室采用B7-H4-Fc融合蛋白進(jìn)行流式細(xì)胞檢測

3、，在肺癌組織浸潤的T細(xì)胞、肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)來源的T淋巴細(xì)胞、炎癥組織浸潤的扁桃體細(xì)胞上檢測到B7-H4受體的表達(dá)。本研究將通過采用Magrose-NHS磁珠和構(gòu)建溴化氫活化瓊脂糖4B親和層析柱，從扁桃體、Jurkat細(xì)胞中分離純化B7-H4受體蛋白并對(duì)其鑒定。利用免疫組化、免疫熒光檢測B7-H4受體在Jurkat細(xì)胞和炎癥浸潤的扁桃體中的表達(dá)及定位，為以后探索B7-H4受體分子在腫瘤浸潤T細(xì)胞上的表達(dá)打下基礎(chǔ)。
　　一、人B7

4、-H4受體的分離與鑒定
　　【目的】大量純化B7-H4受體并對(duì)其檢測，為以后研究B7-H4受體分子提供基礎(chǔ)。
　　【方法】通過采用Magrose-NHS磁珠和構(gòu)建溴化氫活化瓊脂糖4B親和層析柱，從扁桃體細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞中分離純化B7-H4受體蛋白，通過SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色和脫色，觀察目的蛋白條帶。將洗脫蛋白包板，利用ELISA鑒定純化蛋白中是否含有B7-H4受體。
　　【結(jié)果】采用Magrose-NH

5、S磁珠從扁桃體細(xì)胞裂解上清中成功分離純化出B7-H4受體，經(jīng)SDS-PAGE考染后條帶位于170KD上方，將洗脫蛋白包板，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)與B7-H4-Fc-Bio、10A10-Bio反應(yīng)為陽性（P＜0.05）。成功構(gòu)建溴化氫活化瓊脂糖4B-10A10層析柱，大量分離純化B7-H4受體，經(jīng)SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色后在170KD上方發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白，將洗脫蛋白包板后，利用ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)同樣與B7-H4-Fc-Bio、10A1

6、0-Bio均有陽性結(jié)果，經(jīng)Graph Pad Prism分析，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，洗脫蛋白中含有B7-H4受體。
　　【結(jié)論】采用Magrose-NHS磁珠和溴化氫活化瓊脂糖4B-10A10親和層析柱均分離純化得到B7-H4受體蛋白，為進(jìn)一步研究B7-H4受體生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　二、利用B7-H4受體的抗體10A10檢測B7-H4受體在細(xì)胞和組織中的表達(dá)
　　【目的】本研究通過分析B7-H4受體在J

7、urkat細(xì)胞和炎癥浸潤的扁桃體細(xì)胞中的表達(dá)及定位，為以后探索B7-H4受體分子在腫瘤浸潤T細(xì)胞上的表達(dá)打下基礎(chǔ)。
　　【方法】制備扁桃體冰凍切片，利用免疫組化、免疫熒光檢測Jurkat細(xì)胞、扁桃體分選出的部分淋巴細(xì)胞和扁桃體冰凍切片中B7-H4受體的表達(dá)及定位。
　　【結(jié)果】組化結(jié)果顯示，在Jurkat細(xì)胞、扁桃體分選出的部分淋巴細(xì)胞膜表面有散在分布的棕色區(qū)域。扁桃體冰凍切片中，有陽性棕色顆粒呈彌散型分布。免疫熒光結(jié)果顯示