抗B7-H4單鏈抗體的人源化改造、表達(dá)及其生物學(xué)功能鑒定.pdf

1、本研究旨在將抗B7-H4單鏈抗體與人IgG1CH3進(jìn)行連接，對抗B7-H4單鏈抗體進(jìn)行人源化改造，希望得到對腫瘤生長有抑制作用的融合蛋白。本實(shí)驗(yàn)室的先前研究中，已構(gòu)建出抗B7-H4單鏈抗體庫，并且利用核糖體展示技術(shù)篩選出一株鼠源性抗B7-H4的特異性單鏈抗體?？墒?，因?yàn)樵撝陠捂溈贵w缺少Fc段，造成其在體內(nèi)的半衰期短、在血液中容易被清除，且也造成了其在鑒定方面的繁雜。因此，我們將anti-B7-H4-scFv基因與人IgG1CH3基因相連

2、，以此對單鏈抗體進(jìn)行人源化改造。具體結(jié)果如下:
　　1 Anti-B7-H4-scFv-CH3基因的克隆
　　從人外周血單個核細(xì)胞中提取總RNA，然后用RT-PCR擴(kuò)增出人IgG1CH3基因;利用SOE-PCR技術(shù)將anti-B7-H4-scFv基因和人IgG1CH3基因進(jìn)行連接來獲得重組基因;再通過瓊脂糖凝膠電泳和基因測序鑒定重組基因。結(jié)果表明:重組的anti-B7-H4-scFv-CH3基因序列和期望的一致。
　　

3、2 Anti-B7-H4-scFv-CHi3蛋白的表達(dá)、純化及活性檢測
　　將重組基因克隆到原核表達(dá)載體pET43.1a中，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出抗體蛋白;抗體蛋白再經(jīng)鎳柱親和層析(Ni-NTA)純化，純化后的蛋白經(jīng)Western blot鑒定;用ELISA和Western blot鑒定抗體蛋白和B7-H4抗原結(jié)合的特異性和親和性。結(jié)果表明:成功構(gòu)建了抗B7-H4人源化單鏈抗體的表達(dá)體系，獲得

4、與B7-H4抗原親和性和特異性高的可溶性蛋白。
　　3 Anti-B7-H4-scFv-CH3蛋白的生物學(xué)功能檢測
　　為了檢測抗體蛋白的生物學(xué)功能，用C57BL/6小鼠建立了Lewis肺癌皮下移植瘤模型;將荷瘤鼠隨機(jī)分成兩組，注射生理鹽水的為模型組，注射anti-B7-H4-scFv-CH3蛋白的為受試藥組，并從此刻開始記錄兩組小鼠腫瘤體積和小鼠體重的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時處死小鼠剝離瘤塊進(jìn)行稱重，并對腫瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染