鼠抗人B7-H4單克隆抗體的功能研究及可溶性B7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒的優(yōu)化.pdf

1、B7-H4作為一種負(fù)性共刺激分子,它是近年來發(fā)現(xiàn)的B7家族的新成員之一。它可以通過抑制 T細(xì)胞的增殖、活化和細(xì)胞因子的分泌來調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。人類的B7-H4屬于Ⅰ型跨膜蛋白,與其他B7家族成員相比,其胞外部分有20-30％的氨基酸同源性。B7-H4mRNA普遍表達(dá)于人的淋巴組織和非淋巴組織,但B7-H4蛋白在正常外周組織中僅微弱表達(dá)。而健康者新鮮分離的樹突狀細(xì)胞(DCs)、單核細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞均無表達(dá),但在體外經(jīng)活化刺激因子作用

2、后也呈微弱表達(dá)。近年來的研究表明,人的腫瘤細(xì)胞如結(jié)腸,前列腺細(xì)胞以及肺癌和卵巢癌組織等呈現(xiàn)B7-H4的異常表達(dá),提示在腫瘤微環(huán)境中,B7-H4在腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和維持機(jī)體免疫耐受過程中發(fā)揮著重要作用。因此,B7-H4有望成為癌癥患者的診斷、預(yù)后以及治療的靶標(biāo)分子之一。本研究旨在通過Jurkat細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株SPCA-1共培養(yǎng)的方法,利用本室已制備的鼠抗人B7-H4單克隆抗體5G3去封閉SPCA-1細(xì)胞上表達(dá)的B7-H

3、4分子,通過共培養(yǎng),檢測共培養(yǎng)后Jurkat細(xì)胞的生物學(xué)特性的改變。利用本實(shí)驗(yàn)室已制備的可溶性B7-H4(sB7-H4)ELISA試劑盒做進(jìn)一步優(yōu)化,檢測非小細(xì)胞肺癌患者血清中sB7-H4分子的表達(dá)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：鼠抗人B7-H4單克隆抗體的功能研究。
　　目的：體外模擬體內(nèi)環(huán)境對(duì)共培養(yǎng)后Jurkat細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。
　　方法：通過RT-PCR和FCM方法檢測肺腺癌細(xì)胞株SPCA-1上B

4、7-H4表達(dá)水平,SPCA-1細(xì)胞株與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)72h,收集共培養(yǎng)后的Jurkat細(xì)胞,通過FCM方法檢測其細(xì)胞表面CD3和CD69分子表達(dá)變化,Jurkat細(xì)胞的凋亡以及用CCK8方法檢測其細(xì)胞增殖變化。
　　結(jié)果：SPCA-1表達(dá)B7-H4,分子作用于Jurkat細(xì)胞,致使Jurkat細(xì)胞上CD3、CD69分子表達(dá)下調(diào);發(fā)生凋亡作用;細(xì)胞增殖下降。
　　結(jié)論：在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株SPCA-1中,B7-H4分子

5、能夠負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,為研究B7-H4分子在腫瘤免疫中的作用提供了理論基礎(chǔ)。
　　第二部分：sB7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒優(yōu)化并檢測非小細(xì)胞患者血清中的sB7-H4含量。
　　目的：優(yōu)化人 sB7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒并檢測非小細(xì)胞肺癌患者血清中sB7-H4含量。
　　方法：以本室已研制的人sB7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒為基礎(chǔ),采用鼠抗人單抗1F10作為包埋抗體,以生物素(biotin)標(biāo)記的鼠抗人單抗8F10和5G

6、3作為檢測抗體,對(duì)本室已建立的雙抗體夾心sB7-H4酶標(biāo)檢測方法進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者血清中的sB7-H4含量進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：成功優(yōu)化了人sB7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒,檢測抗體以0.4μg/ml的8F10和0.1μg/ml的5G3的組合靈敏度最高,檢測下線可達(dá)0.25ng/ml。用該優(yōu)化后的試劑盒檢測的非小細(xì)胞肺癌患者血清中 sB7-H4(10.53±2.96)μg/ml,高于健康者(9.088±2.43)μg/ml(

7、p<0.05);TNM分期Ⅲ/Ⅳ期 sB7-H4水平為(10.80±3.45)μg/ml,明顯高于Ⅰ/Ⅱ期(10.33±2.67)μg/ml(p<0.05);男性和女性 sB7-H4水平相差不大(p>0.05),分別為(10.61±2.61)μg/ml和(10.38±2.48)μg/ml;年齡大于50歲和小于等于50歲的sB7-H4水平無顯著差異(p>0.05),分別為(10.26±2.54)μg/ml、(10.41±2.65)μg/m

8、l;術(shù)前sB7-H4平(10.75±2.72)μg/ml明顯高于術(shù)后(9.93±2.88)μg/ml(p<0.05)。
　　結(jié)論：成功優(yōu)化了人 sB7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒,用該試劑盒檢測肺癌患者血清中sB7-H4,其含量高于健康者;且與臨床分期、治療情況有關(guān),與年齡和性別無關(guān),sB7-H4有望用于肺癌患者的輔助診斷。綜上所述,成功研究了Jurkat與SPCA-1細(xì)胞共培養(yǎng)后Jurkat細(xì)胞生物學(xué)特性變化,優(yōu)化人sB7-H4酶聯(lián)檢測