人B7-H4基因轉染細胞株的構建與鼠抗人B7-H4單克隆抗體的制備.pdf

1、B7-H4分子是近年發(fā)現的一個新的協同刺激分子，其基因定位于1p11.1，編碼282個氨基酸，屬于免疫球蛋白超家族。人B7-H4分子的mRNA廣泛的存在于淋巴組織和非淋巴組織。新鮮分離的外周血T、B淋巴細胞、單核細胞及樹突狀細胞均無B7-H4的表達，但體外刺激后，均可被誘導表達。近來的研究表明，B7-H4分子屬于負性調節(jié)分子，它可以抑制T細胞的增殖，細胞因子的分泌以及細胞周期的進行，從而下調T細胞的免疫功能。雖然B7-H4蛋白在大多數正

2、常組織中幾乎不表達，但其在一些腫瘤細胞上的過表達，說明B7-H4分子在幫助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視過程中起到重要作用，另外B7-H4在維持機體免疫耐受過程中也起到重要的作用。因此，該分子成為免疫學研究的熱點之一。
　　 本研究旨在通過克隆人B7-H4基因，并建立人B7-H4基因轉染細胞株，研制特異性鼠抗人B7-H4單克隆抗體，并對其生物學功能進行初步的研究。
　　 一、人B7-H4基因轉染細胞株的構建及其生物學功能的初步研究

3、
　　 目的：克隆人B7-H4基因，將其轉染至pIRES2-EGFP真核表達載體，構建人B7-H4轉基因細胞株并初步研究其生物學功能。
　　 方法：通過RT-PCR的方法獲得人B7-H4分子的全長基因，設計特異性引物，通過PCR方法獲得目的片段，將目的片段雙酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)后與pIRES2-EGFP真核表達載體連接，構建重組真核表達載體pIRES2-EGFP/B7-H4并進行鑒定；脂質體轉染法將重組載體導入

4、L929細胞，經G418加壓篩選并通過流式細胞術和RT-PCR檢測表達載體是否轉入L929細胞中，通過檢測活化T細胞上CD25，CD69的表達及T細胞增殖實驗對B7-H4轉基因細胞的生物學功能進行初步研究。
　　 結果：構建了一株穩(wěn)定高表達人B7-H4分子的轉基因細胞株，對其生物學功能的研究顯示B7-H4分子可以下調活化T細胞上CD25，CD69的表達，并且對T細胞的活化增殖起到抑制作用。
　　 結論：成功構建一株穩(wěn)定表

5、達B7-H4分子的基因轉染細胞株，為進一步研制B7-H4分子的單克隆抗體提供了有效的免疫原。
　　 二、B7-H4單克隆抗體的制備及其生物學特性的研究
　　 目的：研制鼠抗人B7-H4分子的單克隆抗體(mAb)并鑒定其生物學特性
　　 方法：以高表達人B7-H4分子的轉基因細胞L929/B7-H4為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴瘤雜交技術，經免疫熒光標記和流式細胞術分析、反復篩選、多次克隆化培養(yǎng)，獲

6、得兩株可特異分泌鼠抗人B7-H4分子單克隆抗體的雜交瘤細胞株。采用快速定性試紙分析法鑒定抗體所屬的Ig亞類。用Dot-blot、Westernblot鑒定單抗的特異性，競爭結合抑制實驗鑒定單抗所識別的抗原結合位點，T細胞增殖抑制阻斷實驗對單克隆抗體的生物學功能進行初步的鑒定。
　　 結果：獲得兩株持續(xù)、穩(wěn)定地分泌抗B7-H4單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別命名為1F10和2B2。Dot-blot的結果顯示，兩株單抗均能特異性識別B7

7、-H4分子。Western blot檢測顯示，單抗2B2可以特異性識別B7-H4分子，而單抗1F10則不能識別。位點競爭實驗表明，兩株單抗之間，單抗1F10與商品化的抗體H74之間識別位點均不同，單抗2B2與商品化抗體識別位點相近。T細胞增殖抑制阻斷實驗顯示，這兩株單抗均能一定程度地阻斷B7-H4對T細胞增殖的抑制作用。
　　 結論：成功地獲得兩株鼠抗人B7-H4分子的單克隆抗體，為進一步研究B7-H4分子的生物學功能提供了有效