人B7-H4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建與鼠抗人B7-H4單克隆抗體的制備.pdf

1、B7-H4分子是近年發(fā)現(xiàn)的一個新的協(xié)同刺激分子，其基因定位于1p11.1，編碼282個氨基酸，屬于免疫球蛋白超家族。人B7-H4分子的mRNA廣泛的存在于淋巴組織和非淋巴組織。新鮮分離的外周血T、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞均無B7-H4的表達(dá)，但體外刺激后，均可被誘導(dǎo)表達(dá)。近來的研究表明，B7-H4分子屬于負(fù)性調(diào)節(jié)分子，它可以抑制T細(xì)胞的增殖，細(xì)胞因子的分泌以及細(xì)胞周期的進(jìn)行，從而下調(diào)T細(xì)胞的免疫功能。雖然B7-H4蛋白在大多數(shù)正

2、常組織中幾乎不表達(dá)，但其在一些腫瘤細(xì)胞上的過表達(dá)，說明B7-H4分子在幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視過程中起到重要作用，另外B7-H4在維持機(jī)體免疫耐受過程中也起到重要的作用。因此，該分子成為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
　　 本研究旨在通過克隆人B7-H4基因，并建立人B7-H4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，研制特異性鼠抗人B7-H4單克隆抗體，并對其生物學(xué)功能進(jìn)行初步的研究。
　　 一、人B7-H4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其生物學(xué)功能的初步研究

3、
　　 目的：克隆人B7-H4基因，將其轉(zhuǎn)染至pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體，構(gòu)建人B7-H4轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株并初步研究其生物學(xué)功能。
　　 方法：通過RT-PCR的方法獲得人B7-H4分子的全長基因，設(shè)計特異性引物，通過PCR方法獲得目的片段，將目的片段雙酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)后與pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP/B7-H4并進(jìn)行鑒定；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體導(dǎo)入

4、L929細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選并通過流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR檢測表達(dá)載體是否轉(zhuǎn)入L929細(xì)胞中，通過檢測活化T細(xì)胞上CD25，CD69的表達(dá)及T細(xì)胞增殖實(shí)驗對B7-H4轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究。
　　 結(jié)果：構(gòu)建了一株穩(wěn)定高表達(dá)人B7-H4分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，對其生物學(xué)功能的研究顯示B7-H4分子可以下調(diào)活化T細(xì)胞上CD25，CD69的表達(dá)，并且對T細(xì)胞的活化增殖起到抑制作用。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建一株穩(wěn)定表

5、達(dá)B7-H4分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為進(jìn)一步研制B7-H4分子的單克隆抗體提供了有效的免疫原。
　　 二、B7-H4單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性的研究
　　 目的：研制鼠抗人B7-H4分子的單克隆抗體(mAb)并鑒定其生物學(xué)特性
　　 方法：以高表達(dá)人B7-H4分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/B7-H4為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴瘤雜交技術(shù)，經(jīng)免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析、反復(fù)篩選、多次克隆化培養(yǎng)，獲

6、得兩株可特異分泌鼠抗人B7-H4分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。采用快速定性試紙分析法鑒定抗體所屬的Ig亞類。用Dot-blot、Westernblot鑒定單抗的特異性，競爭結(jié)合抑制實(shí)驗鑒定單抗所識別的抗原結(jié)合位點(diǎn)，T細(xì)胞增殖抑制阻斷實(shí)驗對單克隆抗體的生物學(xué)功能進(jìn)行初步的鑒定。
　　 結(jié)果：獲得兩株持續(xù)、穩(wěn)定地分泌抗B7-H4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1F10和2B2。Dot-blot的結(jié)果顯示，兩株單抗均能特異性識別B7

7、-H4分子。Western blot檢測顯示，單抗2B2可以特異性識別B7-H4分子，而單抗1F10則不能識別。位點(diǎn)競爭實(shí)驗表明，兩株單抗之間，單抗1F10與商品化的抗體H74之間識別位點(diǎn)均不同，單抗2B2與商品化抗體識別位點(diǎn)相近。T細(xì)胞增殖抑制阻斷實(shí)驗顯示，這兩株單抗均能一定程度地阻斷B7-H4對T細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 結(jié)論：成功地獲得兩株鼠抗人B7-H4分子的單克隆抗體，為進(jìn)一步研究B7-H4分子的生物學(xué)功能提供了有效