壓力對小鼠成骨細胞增殖活性影響的基因表達譜差異分析.pdf

1、目的：在整個生長發(fā)育的過程中，機械力刺激無時無刻不在對機體產生著巨大的作用，尤其體現在骨骼發(fā)育、骨折愈合、骨改建等方面。在骨形成過程中，成骨細胞起著至關重要的作用，且對外界力學刺激敏感。以往學者認為，壓力能促進骨的吸收，不利于骨的形成。然而近年來，越來越多的研究表明，適合的壓力可能會促進成骨細胞的增殖分化，進而對骨的形成起一定促進作用，但目前的研究對成骨細胞受到力學刺激后細胞內生物力學信號的轉導機制尚不明確。本實驗通過體外培養(yǎng)小鼠胚胎成

2、骨細胞MC3T3-E1形成3D細胞薄膜，利用FX-5000C壓力加載系統(tǒng)對其施加10％壓縮率，MTT法檢測壓力對小鼠成骨細胞增殖活性的作用，并利用Affymetrix基因表達譜芯片技術，分析壓力對小鼠成骨細胞差異基因表達的影響，探討壓力對成骨細胞的作用機制，為臨床研究骨改建的機理以及相關疾病的治療和恢復提供理論依據和實驗參考。
　　方法：
　　1.小鼠成骨細胞MC3T3-E1體外培養(yǎng):復蘇凍存的原代小鼠胚胎成骨細胞MC3T3

3、-E1，鏡下觀察細胞生長情況，待細胞長滿瓶底，且生長狀況良好時進行細胞傳代。選取狀態(tài)良好、呈對數期生長的 MC3T3-E1細胞，制備成單細胞懸液，以1×105細胞/孔接種到12培養(yǎng)孔板上，培養(yǎng)28天，形成一層厚度約1~2 mm的3D細胞薄膜備用。
　　2.小鼠成骨細胞體外加載模型的建立:收集3D細胞薄膜，滴入到6個6孔壓力培養(yǎng)板中，將6個6孔壓力培養(yǎng)板隨機分為實驗組1小時（A1組）、4小時（B1組）、8小時（C1組），對照組1小時

4、（A2組）、4小時（B2組）、8小時（C2組）。利用FX-5000C細胞壓力加載系統(tǒng)對實驗組施加頻率為1 Hz（正弦波形），10%的壓縮率，分別加壓1、4、8小時，對照組不加力，同樣條件下培養(yǎng)1、4、8小時。
　　3.小鼠成骨細胞增殖活性的檢測:加力結束后，使用MTT法檢測各組細胞的增殖情況，用酶聯免疫檢測儀在490 nm處檢測各組細胞的吸光度值（OD值），記錄數據，并使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
　　4.小鼠

5、成骨細胞總RNA的提取:選取增殖活性最強的實驗組和相應對照組的細胞，使用TRIZOL法提取細胞的總RNA，測定RNA的純度、濃度及完整性。
　　5.小鼠成骨細胞基因芯片的制備及檢測:將提取的總RNA標本制備全基因組表達譜芯片，繼而進行芯片的洗染和掃描，對得出數據進行檢測并用Transcriptome Analysis Console3.0分析軟件對結果進行分析，篩選差異基因。
　　結果：
　　1.細胞增殖活性MTT實驗

6、結果:對成骨細胞加壓1、4、8小時后，各實驗組與相應對照組吸光度均值（以(-x)±SD表示)， A1組：0.323±0.047， A2組：0.307±0.034；B1組：0.850±0.060，B2組：0.313±0.027；C1組：0.530±0.081，C2組：0.307±0.025；A1組與A2組吸光度值比較無統(tǒng)計學差異；B1組與B2組吸光度值比較有統(tǒng)計學差異；C1組與C2組吸光度值比較有統(tǒng)計學差異；三個對照組細胞吸光度值無統(tǒng)計學

7、差異；三個實驗組細胞吸光度值比較有統(tǒng)計學差異。MTT結果表明：加力1小時時，實驗組與對照組成骨細胞的增殖活性沒有顯著差異；加力4小時時，成骨細胞的增殖活性達到高峰，隨著加力時間的延長，細胞的增殖活性逐漸降低。
　　2.總RNA的濃度、純度及完整性檢測:利用Nanodrop2000/2000 C分光光度計測定結果顯示：B1組（加力4小時組）與B2組（4小時對照組）總RNA的OD260/OD280比值均位于1.8~2.0之間，純度及濃

8、度符合實驗要求。凝膠電泳結果顯示：B1組（加力4小時組）與B2組（4小時對照組）RNA經瓊脂糖凝膠電泳后利用全自動凝膠成像系統(tǒng)(GBOXF3)分析，可見三個條帶出現，28 S條帶亮度約為18 S條帶亮度的兩倍，5 S條帶較淡，說明各組提取的總RNA完整性良好，符合實驗要求。
　　3.小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1全基因組mRNA表達譜差異分析在所分析的34472條小鼠全組基因中，篩選出基因信號上調和下調2倍及以上差異的全部基因，

9、B1組（加力4小時組）與B2組（4小時對照組）成骨細胞之間差異表達顯著的基因共出現3609條，其中上調的基因有1657條，下調的基因有1952條，這些基因的產物涉及細胞信號轉導、增殖、分化、凋亡等多個方面。
　　結論：
　　1.對成骨細胞施加適當的壓力及時間，能增強成骨細胞的增殖活性。
　　2.壓力下成骨細胞基因表達譜發(fā)生改變，Myc、Jun、Fos、Runx2、Wnt10b、Lrp5等成骨相關基因顯著上調。