海州香薷耐銅性和金屬硫蛋白基因克隆及功能分析.pdf

1、重金屬對土壤和水體的污染是主要的環(huán)境問題之一。當重金屬在生物體內(nèi)積累超過一定量時，即會對生物產(chǎn)生毒害。同時重金屬具有不可降解性，對土壤及水體的污染，嚴重影響農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)，并通過食物鏈危及人類的健康。植物體在適應環(huán)境的過程中，逐漸形成了一系列的適應性機制。植物細胞對重金屬毒害的耐性機理之一是合成一些配位基團，與重金屬離子螯合，從而降低細胞質(zhì)中重金屬的自由離子活度。植物細胞中能與重金屬結(jié)合的配位基團包括氨基酸、有機酸等小分子物質(zhì)以及金屬硫蛋

2、白（MTs）、金屬螯合肽（PCs）等小分子量的多肽。本研究通過水培的方法研究了海州香薷（Elsholtzia haichowensis）、野草香（Elsholtzia cypriani）及香薷（Elsholtzia ciliata）三種香薷植物對銅吸收及耐性的比較，分析了銅對三種香薷種子萌發(fā)、幼苗生長及營養(yǎng)元素吸收的影響，同時從海州香薷中獲得了EhMT1基因的全長cDNA，并對EhMT1基因功能進行了初步分析。
　　 實驗結(jié)果表

3、明，50μM Cu處理降低了野草香和香薷胚根及下胚軸的生長，根伸長完全受到抑制；在相同濃度的Cu處理下，海州香薷的生長沒有受到顯著抑制，且地上和根系銅濃度都顯著高于野草香和香薷。當100μM Cu處理時，海州香薷地上部和根系的銅濃度最高可達217和13170 mg/kg DW。銅處理能夠顯著提高海州香薷葉片和根系可溶性蛋白含量，對野草香和香薷沒有顯著的促進作用。結(jié)果顯示，海州香薷比野草香和香薷具有較高的耐性，蛋白可能參與了海州香薷的耐銅

4、性。
　　 本研究又以海州香薷為實驗材料，以5個MT基因cDNA序列（GenBank中登錄號分別為L27813、L02306、X95709、X77254、D78491）為基礎，設計簡并引物，運用RT-PCR和RACE技術，首次從海州香薷中擴增獲得了MT基因cDNA，序列全長為581bp，命名為EhMT1。該cDNA序列經(jīng)BLAS工程序查新確認后在GenBank中登錄，登錄號為DQ059081。EhMT1包含一個225bp的開放閱

5、讀框，編碼74個氨基酸；同時擴增到了一段855bp的序列，經(jīng)序列比對確認是EhMT1的基因組DNA，包含2個內(nèi)含子和3個外顯子。海州1香薷金屬硫蛋白N-端和C-端各含有6個cvs，這12個cys在N-端和C-端的排列分別為CXCXXXCXCXXXCXC和CXCXXXCXCXXCXC（其中X代表任意氨基酸），這種排列結(jié)構(gòu)表明海州香薷EhMT1屬于MT1類。序列比對表明，本研究預測的EhMT1蛋白與其他植物金屬硫蛋白在核苷酸和氧基酸水平都表

6、現(xiàn)很高的相似性，與Mimulus guttatus（玄參科溝酸漿屬植物）MT的相似性最高為75％。組織表達分析表明，EhMT1主要在根中表達，葉片中也有表達，而在莖中檢測不到該基因的表達。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，Cu脅迫能夠上調(diào)EhMT1基因的表達，同時EhMT1基因還受熱激處理和氧化脅迫的誘導。
　　 通過構(gòu)建原核表達載體，進行EhMT1基因的原核表達分析。經(jīng)IPTG誘導，得到了約18KDa的融合蛋白。在各種脅迫處理下，轉(zhuǎn)

7、化pET-30a-EhMT1的大腸桿菌重組子要比轉(zhuǎn)化pET-30a空載體的對照菌生長明顯旺盛。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入EhMT1基因，提高了大腸桿菌對各種非生物脅迫的耐性。構(gòu)建EhMT1基因瞬時表達載體轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞，對GUS報告基因染色發(fā)現(xiàn)海州香薷EhMT1編碼產(chǎn)物主要定位在洋蔥表皮細胞的細胞質(zhì)中，這與前人報道的結(jié)果是一致的。另外，我們構(gòu)建了植物表達載體pBI121-EhMT1用于轉(zhuǎn)基因煙草，目前已獲得了EhMT1基因過量表達的煙草轉(zhuǎn)基因植株