棉花鹽脅迫誘導(dǎo)cDNA文庫的構(gòu)建與篩選及棉花金屬硫蛋白基因功能分析.pdf

1、棉花是較耐鹽堿的作物之一，在鹽堿地區(qū)有大面積種植，已取得良好的經(jīng)濟效益和社會效益。但棉花的耐鹽能力仍然有限，常規(guī)品種耐鹽能力一般只有0.3％。所以，要在鹽堿地廣泛種植棉花，必須進一步提高棉花的耐鹽能力。國內(nèi)外在這方面做了大量研究，然而分子水平的研究還有待于進一步的深入下去。因此本研究分別以耐鹽棉花品種中棉19號為試材，構(gòu)建了棉花鹽脅迫誘導(dǎo)cDNA文庫，并通過反向northern差異篩選法獲得十七個與鹽脅迫相關(guān)的棉花基因克隆。并選擇5號和

2、17號克隆為研究對象，對這兩個克隆的序列及同源性分析表明二者屬于棉花金屬硫蛋白基因家族成員。 金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類低分子量(6000～9000Da)、高Cys含量、具有金屬結(jié)合能力的多肽，它具有獨特的氨基酸排列順序，即多肽的N端和C端具有兩個富含Cys的金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中的Cys按CXnC的方式排列。MT基因和蛋白廣泛存在于動物、植物、真菌、綠藻中。植物金屬硫蛋白有其獨特的序列和結(jié)構(gòu)特點。根

3、據(jù)植物金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)特點，植物MT分為三類。5號克隆編碼的GhMTl與17號克隆編碼的GhMT2為棉花Ⅰ類金屬硫蛋白。對這兩個基因進行序列比較、表達分析和功能鑒定。 主要結(jié)果如下：1.利用ClontechK1053-1(634903)SmartTMcDNALibraryConstructionKit構(gòu)建棉花鹽脅迫誘導(dǎo)cDNA文庫，經(jīng)效價測定完全合格。 2.通過反向northern差異篩選法獲得十七個在鹽脅迫和正常條件下

4、表達有差異的克隆。 3.5號克隆和17號克隆的序列同源性分析表明，二者的核苷酸序列的同源性為91.15％，氨基酸同源性為85.94％，可以斷定二者為同一棉花基因家族成員。該基因家族編碼蛋白與復(fù)盆子、葡萄、中華獼猴桃、番木瓜等許多植物中的Ⅰ類金屬硫蛋白的同源性為70.1％，具有典型的植物Ⅰ類金屬硫蛋白序列特點，聚類分析表明該棉花基因家族與復(fù)盆子、葡萄、中華獼猴桃、番木瓜等植物的Ⅰ類金屬硫蛋白具有較近的親緣關(guān)系。因此，可以斷定二者屬

5、于植物Ⅰ類金屬硫蛋白，命名為GhMT1、GhMT2。 4.Northern表達分析表明GhMT1受NaCl脅迫誘導(dǎo)表達，在一定的時間范圍內(nèi)其表達水平隨NaCl誘導(dǎo)時間的延長而增加，但是在鹽脅迫條件下不能被快速誘導(dǎo)。GhMT1也能被CuSO4、ZnSO4、低溫、干旱、ABA和乙烯誘導(dǎo)，說明GhMT1具有金屬硫蛋白受重金屬誘導(dǎo)的功能，也說明對鹽脅迫的非專一性，而是受各種非生物脅迫的誘導(dǎo)。同時暗示著GhMT1受ABA和乙烯信號途徑的調(diào)

6、控，可能是ABA、乙烯信號途徑的靶基因。 5.Northern表達分析還表明在抗氧化劑N-乙?；?L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)存在的條件下，GhMT1不受NaCl、低溫、干旱、百草枯(PQ，paraquat)的誘導(dǎo)。對過氧化氫相對水平的測定結(jié)果表明，NAC有效的抑制了NaCl、低溫、干旱脅迫條件下過氧化氫水平。說明活性氧自由基是非生物脅迫誘導(dǎo)GhMT1及其同源家族表達的重要信號物質(zhì)。 6

7、.GhMT1和GhMT2在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達，用GhMT1和GhMT2特異探針標(biāo)記的northern雜交結(jié)果說明GhMT1和GhMT2只在轉(zhuǎn)基因植株中表達。同野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草能使轉(zhuǎn)基因煙草在200，300mMNaCl條件下，4℃條件下，25％PEG條件下較好的生長。說明GhMT1及其同源家族能提高植物的抗鹽能力，也能提高植物的抗其它主要非生物脅迫的能力。 7.對轉(zhuǎn)基因煙草生理指標(biāo)測定結(jié)果表明，在鹽、4℃、25％PEG脅迫