通陽(yáng)逐瘀法激活MAPKs-IL-6信號(hào)通路抗急性心肌缺血作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 通過(guò)辛溫通陽(yáng)中藥蔥白提取物和逐瘀中藥大黃提取物不同配伍比例治療急性心肌缺血的對(duì)比研究,探討通陽(yáng)逐瘀法對(duì)急性心肌缺血大鼠MAPKs/IL-6信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究,初步揭示通陽(yáng)逐瘀法治療急性心肌缺血的生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 本研究選用健康純種SD雄性大白鼠,體重為200-230克,3-4月齡64只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、空白模型組、蔥白提取物組、蔥白提取物與大黃提取物7:3、5:5、3:

2、7組、大黃提取物組及硝酸甘油組,共8組,每組8只。參照郭延松等的方法制備急性心肌缺血模型,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將大鼠腹腔注射3.5％戈巴比妥鈉腹腔注射(35mg/kg)麻醉,仰位固定于鼠板上,將大鼠號(hào)powerlab/8s型八導(dǎo)數(shù)據(jù)分析記錄儀連接好,于開(kāi)胸前記錄一段正常心電圖,隨后將大鼠氣管切開(kāi)連Y型氣管插管,另一端連與動(dòng)物微量呼吸機(jī)出氣孔,以10×60ml/min持續(xù)進(jìn)氣,然后開(kāi)胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈制備急性心肌缺血模型,于造模后十二指腸給藥

3、,4小時(shí)后觀察相關(guān)指標(biāo),各藥物組給相應(yīng)濃度藥物,假手術(shù)組與模型組給予同體積的生理鹽水,用注射器于結(jié)扎后5分鐘給藥,4h后采集血樣及心臟。在腹部中線偏左開(kāi)口,找到十二指腸備用,用生理鹽水紗布覆蓋傷口,4小時(shí)后采集血樣及心肌組織,觀察相關(guān)指標(biāo),給藥體積為2ml/kg,正常對(duì)照組和空白模型組給與同等體積生理鹽水、蔥白提取物組按600mg·kg-1給藥、大黃提取物組按400mg·kg-1給藥、蔥白提取物與大黃7:3、5:5、3:7組按蔥白與大黃

4、上述濃度混合、硝酸甘油組按80mg·kg-1給藥,觀察4小時(shí)后,再次檢測(cè)心電圖,觀測(cè)完畢后,立即以血管鉗暫時(shí)夾閉大鼠胸壁,快速行大鼠腹主動(dòng)脈取血,立即將其中2ml血注入含有10%EDTA二鈉30μl和胰肽酶40μl的試脈中,混勻,4℃,3000rpm離心10min,分離血漿,放置于-70℃冰箱中保存待測(cè),其余血3500rpm離心20min,取上清,分裝后置于-70℃冰箱中保存待測(cè)。測(cè)定前,將樣本置于冷水中復(fù)融,混勻,再次4℃,3000r

5、pm離心5min,取上清液測(cè)定。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)碾妶D觀測(cè)(標(biāo)準(zhǔn)電壓為0.1mv,走紙速度50mm/s),分別分別記錄給藥前后心電圖,測(cè)量ST段上移平均數(shù),給藥前后心電圖ST段變化。
　　 通過(guò)眥染色分析大鼠心肌組織病理變化,ELISA法檢測(cè)血清cTnI、CK-MB、LDH、IL-6的含量。采用化學(xué)方法檢測(cè)心肌組織}t2S含量。WesternBlot法檢測(cè)P-ERK、P-JNK、P-p38在急性心肌缺血大鼠心肌組織中的表達(dá),用實(shí)時(shí)熒

6、光定量PCR技術(shù)檢測(cè)急性心肌缺血大鼠心肌組織中IL-6mRNA的表達(dá);采用超聲技術(shù)檢測(cè)急性心肌缺血大鼠心功能。
　　 結(jié)果：
　　 1.對(duì)急性心肌缺血大鼠心電圖、左心功能、心肌損傷標(biāo)志物的影響:與正常對(duì)照組之間比較,空白模型組大鼠ST段顯著升高(P＜0.01);與空白模型組比較,大黃提取物組無(wú)顯著性差異(P＞0.05),其余各治療組織組均可降低大鼠ST段(P＜0.05,P＜0.01),蔥白提取物組效果最為顯著(P＜0.0

7、1),通陽(yáng)逐瘀組之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。
　　 與正常對(duì)照組比較,空白模型組大鼠血清cTnI明顯升高(P＜0.01);與空白模型組比較,各治療組大鼠血清cTnI水平明顯降低(P＜0.05,P＜0.01),蔥白提取物組降低最為明顯,優(yōu)于各治療組,通陽(yáng)逐瘀組之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)
　　 與正常對(duì)照組比較,空白模型組大鼠血清CK-MB明顯升高(P＜0.01)。與空白模型組比較,各治療組大鼠血清CK-MB明顯

8、降低(P＜0.05,P＜0.01),蔥白提取物組與硝酸甘油組降低最為明顯,組間無(wú)顯著差異(P＞0.05),蔥白提取物組療效優(yōu)于大黃提取物組及通陽(yáng)逐瘀組。
　　 與正常對(duì)照組比較,空白模型組大鼠血清LDH明顯升高(P＜0.01)。與空白模型組比較,各治療組大鼠血清LDH明顯降低(P＜0.05,P＜0.01),大黃提取物組、通陽(yáng)逐瘀組和硝酸甘油組之間相比較無(wú)顯著性差異,優(yōu)于蔥白提取物組,通陽(yáng)逐瘀組之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。<

9、br>　　 與正常組比較,空白模型組EF、FS、Em/Am值明顯降低(P＜0.01);與模型組比較,各治療組EF,FS值、Ern/Am(除大黃提取物組外)值明顯升高(P＜0.01);對(duì)EF值和FS值的影響,通陽(yáng)逐瘀組之間、通陽(yáng)逐瘀組和蔥白提取物組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05),優(yōu)于大黃提取物組和硝酸甘油組(P＜0.05);對(duì)Em/Am值的影響,通陽(yáng)逐瘀組之間、通陽(yáng)逐瘀組和硝酸甘油組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05),優(yōu)于蔥白提取物組。

10、　　 2.對(duì)急性心肌缺血大鼠組織形態(tài)學(xué)的影響心肌組織切片經(jīng)HE染色,光鏡下觀察各組大鼠心肌細(xì)胞病理變化,結(jié)果顯示:正常組:大部分心肌纖維結(jié)構(gòu)正常,排列成束,心肌細(xì)胞橢圓形或短梭形,位于細(xì)胞中央,肌纖維間散在毛細(xì)血管。模型組:心肌纖維腫脹,部分心肌纖維斷裂,可見(jiàn)小灶性肌纖維壞死,肌纖維結(jié)構(gòu)不清清;肌纖維間毛細(xì)血管擴(kuò)張充血,及炎細(xì)胞灶性浸潤(rùn)。蔥白提取物組大部分心肌纖維結(jié)構(gòu)正常,僅見(jiàn)少數(shù)肌纖維腫脹,排列成束,肌纖維間散在毛細(xì)血管,未見(jiàn)灶性壞

11、死。通陽(yáng)逐瘀(7:3)組部分心肌纖維結(jié)構(gòu)正常,見(jiàn)少數(shù)肌纖維腫脹,肌纖維間毛細(xì)血管增多。其余各治療組可見(jiàn)部分心肌腫脹,結(jié)構(gòu)模糊,部分心肌纖維斷裂,肌纖維間少數(shù)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血管增多。
　　 3.對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌組織H2S的影響與正常對(duì)照組比較,空白模型組H2S水平明顯降低(P＜0.01);與空白模型組比較,各治療組H2S水平顯著升高(P＜0.01),通陽(yáng)逐瘀(7:3)組升高H2S水平最為顯著,明顯優(yōu)于蔥白提取物組、大黃提取物

12、組、硝酸甘油組和其它通陽(yáng)逐瘀組。
　　 4.對(duì)急性心肌缺血大鼠MAPKs的影響與正常對(duì)照組比較,模型組P-ERK的表達(dá)顯著升高(22.54%),提示造模成功。與模型組比較,除通陽(yáng)逐瘀(7:3)組外(P＞0.05),其余各治療組P-ERK顯著減少,各干預(yù)組抑制率分別為:通陽(yáng)逐瘀(5:5)組為6.29%、硝酸甘油組為8.94%、蔥白提取物組為9.05%、大黃提取物組為11.17%、通陽(yáng)逐瘀(3:7)組為13.34%。
　　

13、與正常對(duì)照組比較,模型組P.JNK蛋白表達(dá)顯著升高(44.58%),提示造模成功。與模型組比較,各治療組P-JNK顯著降低。各干預(yù)組抑制率分別為:通陽(yáng)逐瘀(3:7)組為14.17%、通陽(yáng)逐瘀(5:5)組為24.83%、大黃提取物組為25.59%、蔥白提取物組為26.37%、硝酸甘油組為26.56%、通陽(yáng)逐瘀(7:3)組為31.73%。
　　 與正常對(duì)照組比較,模型組P.p38蛋白表達(dá)顯著升高(88.0%),提示造模成功。與模型組

14、比較,各治療組P-p38表達(dá)顯著降低,各干預(yù)組抑制率分別為:大黃提取物組為18.91%、通陽(yáng)逐瘀(3:7)組為24.31%、通陽(yáng)逐瘀(5:5)組為31.64%、蔥白提取物組為44.20%、通陽(yáng)逐瘀(7:3)組為45.25%、硝酸甘油組為45.29%。
　　 5.對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌組織IL-6的影響與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠血清IL-6含量明顯升高(P＜0.01);與空白模型組比較,除通陽(yáng)逐瘀(3:7)組外,其余各治療組均可

15、以降低血清IL-6含量,通陽(yáng)逐瘀(7:3)組降低血清IL-6水平最為顯著(P＜0.01),優(yōu)于通陽(yáng)逐瘀(5:5)組、蔥白提取物組、大黃提取物組和硝酸甘油組(P＜0.05)。
　　 與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠心肌組織IL-6mRNA水平明顯升高(P＜0.05),擴(kuò)增倍數(shù)為1.00;與空白模型組比較,各治療組均可降低IL-6mRNA水平,個(gè)干預(yù)組抑制率分別為:蔥白提取物組為16.49%、硝酸甘油組為27.33%、大黃提取物組為30

16、.5%、通陽(yáng)逐瘀(5:5)組為41.32%、通陽(yáng)逐瘀(3:7)組為41.96%、其中通陽(yáng)逐瘀(7:3)組為45.98%。
　　 結(jié)論：
　　 ①通陽(yáng)逐瘀法干預(yù)急性心肌缺血的免疫機(jī)制可能與激活MAPKs及IL-6mRNA表達(dá),影響MAPKs/IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。
　　 ②通陽(yáng)逐瘀法通過(guò)改善心電圖、提高心功能、抑制心肌酶外漏,減輕心肌損傷。
　　 ③通陽(yáng)逐瘀法通過(guò)對(duì)氣體信號(hào)分子H2S的調(diào)控發(fā)揮對(duì)缺血心肌