SIRT1信號(hào)通路介導(dǎo)補(bǔ)骨脂酚抗心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　缺血性心臟病，又稱為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê?jiǎn)稱冠心病），已經(jīng)成為全世界人口死亡的第一病因。已有證據(jù)表明，冠狀動(dòng)脈硬化斑塊堵塞血管造成的心肌缺血會(huì)導(dǎo)致心肌組織損傷，血管堵塞解除后，心肌組織重新獲得血液供應(yīng)的過(guò)程，也會(huì)進(jìn)一步造成心肌組織損傷，這種過(guò)程與現(xiàn)象被稱之為缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，IRI）。目前用于防治心肌IRI的藥物很多，但是鑒于這些藥物的副作用、安全性、倫

2、理方面等問(wèn)題，至今仍然未能獲得理想的心肌保護(hù)藥物。
　　補(bǔ)骨脂酚（Bakuchiol，BAK）是一種從豆科植物補(bǔ)骨脂的種子中分離出來(lái)的單萜酚，對(duì)肝臟、皮膚等多個(gè)臟器具有保護(hù)功能。近來(lái)的研究表明，補(bǔ)骨脂酚具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括抗氧化、抗炎性反應(yīng)、抗衰老和抗糖尿病等效應(yīng)。由于氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和糖尿病狀態(tài)都是心肌缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制的重要組成部分，提示補(bǔ)骨脂酚可能具有抗心肌缺血再灌注損傷的效果。
　　沉默信息調(diào)制因子1（S

3、ilent information regulator1，SIRT1）是一種組蛋白脫乙?；?，依賴于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（ nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，在熱量攝入限制（calorie restriction）介導(dǎo)的長(zhǎng)壽機(jī)制中發(fā)揮重要作用，大量研究證實(shí)其具有顯著的心肌保護(hù)效應(yīng)。白藜蘆醇（一種酚類天然抗毒素）被認(rèn)為是SIRT1的天然激動(dòng)劑。有研究表明，白藜蘆醇的心肌保護(hù)效

4、應(yīng)是由SIRT1信號(hào)通路介導(dǎo)，通過(guò)抗氧化應(yīng)激和改善線粒體功能實(shí)現(xiàn)的。此外，SIRT1可以激活過(guò)氧化物酶體增生物激活受體-γ的共激活因子-1α（ peroxisome proliferator-activated receptor-γ co-activator-1α， PGC-1α）抑制氧化損傷的。PGC-1α活性的上調(diào)依賴于SIRT1途徑的激活，對(duì)缺血/再灌注的大腦和腎臟組織具有保護(hù)作用。組織缺血再灌注后SIRT1/PGC-1α通路的激

5、活會(huì)加速線粒體的生物生成動(dòng)力學(xué)平衡，促進(jìn)線粒體蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能恢復(fù)，從而緩解線粒體損傷。
　　補(bǔ)骨脂酚是白藜蘆醇的類似物，分子結(jié)構(gòu)類似于白藜蘆醇，本課題的科學(xué)假設(shè)是補(bǔ)骨脂酚的抗心肌缺血再灌注損傷效應(yīng)也有可能是通過(guò)SIRT1途徑實(shí)現(xiàn)的，本課題研究目的明確補(bǔ)骨脂酚的心肌保護(hù)效應(yīng)，同時(shí)明確SIRT1/PGC-1α信號(hào)途徑在補(bǔ)骨脂酚心肌保護(hù)機(jī)制中的作用。
　　研究目的：
　　1.研究補(bǔ)骨脂酚是否具有抗心肌IRI作用與機(jī)制。<

6、br>　　2.明確補(bǔ)骨脂酚是否通過(guò)調(diào)控SIRT1通路發(fā)揮抗心肌IRI的保護(hù)作用。
　　材料和方法：
　　實(shí)驗(yàn)材料：
　　成年SD大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雄性，體重220-250g。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.離體心臟IRI模型建立及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)；
　　2.乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法及SIRI模型建立；
　　3. TUNEL法凋亡檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；
　　4.離體心臟冠脈流出液和細(xì)胞培

7、養(yǎng)液中LDH和CK-MB檢測(cè)；
　　5.心肌線粒體氧化應(yīng)激各項(xiàng)指標(biāo)；
　　6. Western blot檢測(cè)相關(guān)分子蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.補(bǔ)骨脂酚劑量依賴性上調(diào)大鼠正常離體灌注心臟SIRT1蛋白表達(dá)(P<0.05)。
　　2.補(bǔ)骨脂酚（0.25、0.5或1μM）預(yù)處理顯著改善大鼠模擬缺血后心臟的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，劑量依賴性地降低心肌組織的凋亡細(xì)胞指數(shù)和心臟冠脈流出液中LDH和CK-MB含量(P<0.

8、05)。
　　3.補(bǔ)骨脂酚預(yù)處理減輕IRI誘發(fā)的線粒體氧化應(yīng)激損傷(P<0.05)。
　　4.補(bǔ)骨脂酚（0.25、0.5或1μM）在缺血前灌注5min，劑量依賴性地提高大鼠心臟組織中SIRT1、PGC-1α和Bcl2蛋白的表達(dá)，降低Bax蛋白的表達(dá)，其中以1μM補(bǔ)骨脂酚處理作用最明顯(P<0.05)。
　　5. SIRT1抑制劑sirtinol抑制補(bǔ)骨脂酚對(duì)大鼠離體心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和心肌損傷的保護(hù)效應(yīng)(P<0.05)

9、。
　　6. SIRT1抑制劑sirtinol抑制補(bǔ)骨脂酚對(duì)大鼠離體心臟線粒體氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)的保護(hù)效應(yīng)(P<0.05)。
　　7.補(bǔ)骨脂酚（1μM）處理顯著提高大鼠缺血再灌注離體心臟組織中SIRT1、PGC-1α和Bcl2蛋白表達(dá)，降低Bax蛋白表達(dá)。SIRT1特異性抑制劑Sirtinol逆轉(zhuǎn)補(bǔ)骨脂酚對(duì)這些蛋白表達(dá)的影響(P<0.05)。
　　8.大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷模型得到了一致的結(jié)果。補(bǔ)骨脂酚處理可顯著提高

10、大鼠心肌細(xì)胞SIRI后細(xì)胞活力、減少心肌細(xì)胞凋亡率、減少培養(yǎng)液中LDH水平，SIRT1 siRNA可以逆轉(zhuǎn)補(bǔ)骨脂酚的保護(hù)作用。氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， SIRT1 siRNA具有能夠逆轉(zhuǎn)補(bǔ)骨脂酚抗線粒體氧化應(yīng)激損傷的作用(P<0.05)。
　　9.相關(guān)分子檢測(cè)顯示，補(bǔ)骨脂酚可以顯著提高大鼠心肌細(xì)胞SIRI后SIRT1、PGC-1α和Bcl2蛋白表達(dá)，降低Bax蛋白表達(dá)，SIRT1 siRNA可以逆轉(zhuǎn)補(bǔ)骨脂酚的保護(hù)作用(P<0.0