IL-6對TGF-β1-Smad3信號通路介導(dǎo)缺血心肌重構(gòu)的影響及作用機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　本研究首先通過臨床觀察研究，分析缺血性心臟病行狹窄冠脈血管完全再血管化、不完全再血管化和單純藥物治療后6個月、12個月心功能、心臟重構(gòu)指標(biāo)和心肌缺血程度的變化，觀察各時間點(diǎn)血清IL-6的動態(tài)變化，并分析IL-6的動態(tài)變化與心功能改變和心臟重構(gòu)指標(biāo)改變的相關(guān)性;為進(jìn)一步探討IL-6對TGF-β1信號路徑在心肌重構(gòu)中的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，通過結(jié)扎大鼠左前降支血管建立心肌缺血模型，觀察外源性IL-6刺激或抑制后心肌炎癥反應(yīng)

2、、纖維化情況及IL-6、TGF-β1、Smad3信號分子表達(dá)情況，分析這些指標(biāo)變化對梗死動物心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)和心功能的影響;由于心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）是導(dǎo)致梗死心肌重構(gòu)以及心臟修復(fù)的關(guān)鍵因素，故進(jìn)一步利用缺氧培養(yǎng)CFs模型，觀察外源性IL-6刺激或抑制對CFs凋亡及增殖的影響，檢測相關(guān)炎癥因子和心肌纖維化指標(biāo)變化情況，目的旨在探究IL-6對TGFβ1/Smad3信號通路介導(dǎo)心肌成纖維化的影響及作用機(jī)

3、制，為改善心肌重構(gòu)保護(hù)心功能提供新的治療思路。
　　方法：
　　臨床部分:入選多家心血管住院的缺血性心臟病伴嚴(yán)重心衰的患者66例，按指南及患者意愿接受完全再血管化(CR)+標(biāo)準(zhǔn)藥物治療(D)、不完全再血管化(IR)+標(biāo)準(zhǔn)藥物治療(D)和單純標(biāo)準(zhǔn)藥物治療(D)三種治療方式，并分為3組，CRD組(n=14)、IRD組(n=34)和D組(n=18)。隨防觀察治療后6個月和12個月，患者心功能和心臟重構(gòu)指標(biāo)的變化，同時觀察各時間點(diǎn)血

4、清IL-6的動態(tài)變化，并分析IL-6的動態(tài)變化與心功能改變和心臟重構(gòu)指標(biāo)改變的相關(guān)性。
　　動物實(shí)驗(yàn)部分:通過結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支建立大鼠心肌缺血模型，隨機(jī)對動物進(jìn)行IL-6或IL-6受體抑制劑干預(yù)，并將動物分為冠脈結(jié)扎(Ligation，LI)+生理鹽水(NS)組（LINS組）;冠脈結(jié)扎(LI)+IL-6(IL)組（LIIL組）和冠脈結(jié)扎(LI)+ IL-6受體抑制劑(LIR)組(LIILR組)，同時設(shè)立假結(jié)扎組(SHAM組

5、)為對照組。將IL-6及IL-6受體抑制劑(Tocilizumb)于心肌梗死模型制備即刻4個點(diǎn)注射到各組動物梗死心肌及周邊。建模后1w、2w分別對各組大鼠進(jìn)行超聲心動圖檢查，測量大鼠左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。術(shù)后2周處死大鼠，心臟經(jīng)石蠟包埋制成石蠟切片。切片進(jìn)行H&E染色，顯微鏡觀察病理變化和梗死面積;Masson染色評估梗死邊緣區(qū)纖維化程度，檢測心肌膠原沉積情況和心肌結(jié)構(gòu)

6、的變化;免疫組織化學(xué)法檢測心肌組織IL-6和TGF-β1表達(dá)。梗死組織均漿的上清液用ELISA方法行炎癥指標(biāo)MPO、IL-6，氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS及纖維化指標(biāo)TGF-β1、MMP2、MMP9等細(xì)胞因子的測定。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:從新生大鼠的心臟分離培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞(CFs)，通過Vimentin免疫熒光檢測鑒定所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為CFs，建立心肌成纖維細(xì)胞缺氧培養(yǎng)模型（培養(yǎng)條件:37℃，5％ CO2，2.5％O2）。隨機(jī)分為四組:C

7、Fs常氧培養(yǎng)組（培養(yǎng)條件:37℃，5％ CO2，20％O2）;缺氧培養(yǎng)CFs組(H-CFs);缺氧培養(yǎng)CFs+ IL-6受體抑制劑組(H-CFs+antiIL-6r);缺氧培養(yǎng)CFs+ IL-6組（H-CFs+IL-6）。用CCK-8試劑盒檢測上述各組細(xì)胞培養(yǎng)0、24h、48h、72h的增殖能力;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況;Realtime-PCR、Western blot等技術(shù)觀察各組細(xì)胞中IL-6、TGF-β1、Smad3、MMP2

8、/9等信號分子mRNA和蛋白水平表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　臨床部分:各組隨心肌缺血程度不同，其生存率明顯不同，完全血運(yùn)重建組（CRD組）為94％，不完全血運(yùn)重建組（IRD組）為91％，單純藥物治療組（D組）為86％口CRD組和IRD組術(shù)后6月較入院時NYHA心功能分級從術(shù)前Ⅲ～Ⅳ級改善為Ⅱ～Ⅲ級，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)較術(shù)前升高(P＜0.01)，心功能改善程度均好于D組（P＜0.01），術(shù)后12個月進(jìn)一步改善，但I(xiàn)RD改

9、善程度不如CRD組。
　　心衰定量標(biāo)志物血清生化指標(biāo)NT-proBNP變化與心功能結(jié)果相一致，三組入院治療后，NT-proBNP隨心功能改善而降低，CRD組6個月時下降最明顯，IRD組次之，D組下降幅度最?。ň鵓＜0.01），各組12個月時較6個月比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　室壁運(yùn)動積分指數(shù)WMSI，在D組入院與6個月、12個月隨訪時比較無統(tǒng)計學(xué)意義。CRD組術(shù)后6個月WMSI明顯降低(P＜0.01)，并持續(xù)到1

10、2個月（P＜0.01）。IRD組術(shù)后6月時WMSI較入院時有明顯降低（P＜0.05），但與術(shù)后12個月比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　心臟結(jié)構(gòu)指標(biāo)(LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV) PCI組術(shù)后6個月、12個月均較PCI前顯著縮小(P＜0.01)，CRD組改善更明顯，優(yōu)于IRD組(P＜0.01)，而D組隨訪6個月LVEDD、LVEDV雖較入院時有所縮?。≒＜0.01），但12個月隨訪時未出現(xiàn)繼續(xù)改善現(xiàn)象（P＞

11、0.05）。
　　血清學(xué)檢測顯示，炎癥指標(biāo)IL-6和心肌壞死指標(biāo)hs-cTnT各組入院時均明顯高于正常值，CRD組手術(shù)后6個月時下降至正常值（P＜0.01），延續(xù)到12月;IRD組IL-6和hs-cTnT6個月較入院時也有明顯下降（P＜0.01），但術(shù)后12個月略高出正常值;D組IL6和hs-cTnT在正規(guī)藥物治療后有降低趨勢，與治療后6月和12月無明顯差異（P＞0.05）。
　　相關(guān)分析顯示，CRD組IL-6的變化值與心功

12、能指標(biāo)變化值HYHA和NT-proBNP呈明顯正相關(guān)（各相關(guān)系數(shù)為0.6614，和0.8356），與LVEF變化值呈明顯負(fù)相關(guān)(-0.7604);與心臟重構(gòu)指標(biāo)呈明顯正相關(guān)(LVEDD0.8335，LVESD0.7987，LVEDV0.8323，LVESV0.8365);與心肌壞死指標(biāo)hs-cTnT呈明顯正相關(guān)(0.8856);與室壁運(yùn)動積分指數(shù)WMSI呈明顯正相關(guān)(0.8393)。
　　動物部分:成功建模后的大鼠術(shù)后生存率比較:

13、 LIILR組生存率為90％，明顯高于其它兩組（LINS組65％，LIIL組50％，均p＜0.01）。術(shù)后1w、2w分別行心臟超聲，結(jié)果顯示，心肌梗死動物的LVEF和LVFS呈進(jìn)行性下降，LVEDD和LVESD呈進(jìn)行性擴(kuò)張，與SHAM組相比LINS組心功能明顯下降，LIIL組心功能最差，而LIILR組高于LINS和LIIL組(均P＜0.05)。建模后2w心肌組織切片H&E染色觀察發(fā)現(xiàn)LINS、LIIL、LIILR三組較SHAM組炎癥反應(yīng)

14、明顯，LIIL炎癥反應(yīng)最嚴(yán)重，LIILR則較LINS組和LIIL組明顯減弱。組織勻漿中的MPO、ROS水平與HE染色的鏡下炎癥改變程度一致。Masson染色顯示，相比于SHAM組，LINS組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)內(nèi)藍(lán)色膠原纖維增多，分割心肌束，一些膠原纖維出現(xiàn)融合，心肌纖維化程度增加。LIIL組心肌組織中藍(lán)綠的膠原纖維更多，膠原沉積明顯增加，加入IL-6受體抑制劑則抑制了LIILR組膠原生成。梗死組織勻漿中IL-6、TGF

15、-β1、MMP2/9水平都明顯高于SHAM組，LIIL組最高，而LIILR組則明顯低于LINS組和LIIL組(P＜0.05)。免疫組化顯示LINS組、LIIL組、LIILR組中均有IL-6和TGF-β1表達(dá)，染色半定量分析，提示LIIL組相比于LINS組IL-6和TGF-β1表達(dá)更多，LIILR則明顯低于LINS組和LIIL組(P＜0.05)。
　　細(xì)胞部分:成功分離得到原代乳鼠心肌成纖維細(xì)胞，CFs鏡下呈現(xiàn)梭形，用Vimenti

16、n免疫熒光檢測加以鑒定。CFs組在培養(yǎng)24h、48h和72h后細(xì)胞密度呈進(jìn)行增加(P＜0.05)，H-CFs組細(xì)胞增殖明顯降低，加入IL-6后進(jìn)一步降低CFs增殖，使CFs在培養(yǎng)后各點(diǎn)無顯著性差異，加入IL-6受體抑制劑后則顯著增加細(xì)胞增殖，使H-CFs+anti-IL-6r組細(xì)胞增殖率在培養(yǎng)24h、48h和72h后明顯高于H-CFs組和H-CFs+IL-6組(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，CFs組細(xì)胞凋亡率僅為0.2％

17、左右，而行缺氧培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡率明顯增加，加IL-6后凋亡進(jìn)一步增加，給予anti-IL-6r后可明顯抑制細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。各組的細(xì)胞勻漿行RT-PCR和WB方法檢測，與CFs組相比，H-CFs組、H-CFs+IL-6組、H-CFs+antiIL-6r組三組IL-6、TGF-β1、Smad3、MMP2、MMP9細(xì)胞因子的mRNA和蛋白表達(dá)量均增加，H-CFs+IL-6組表達(dá)量最高，而加IL-6受體抑制劑組則明顯降低上述因子的表達(dá)(

18、P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1. 臨床上缺血心臟的心功能和重構(gòu)指標(biāo)隨著冠脈介入后的心肌缺血程度改善而改善，血清IL-6水平也隨之改善，而且IL-6變化與心臟功能和重構(gòu)指標(biāo)改變呈明顯相關(guān)。
　　2. IL-6可促進(jìn)梗死心肌的炎癥反應(yīng)，使膠原合成與分泌增加促進(jìn)組織纖維化，是左室重構(gòu)的重要調(diào)控信號分子。
　　3. IL-6對心室重構(gòu)的促進(jìn)作用可能是由IL6/TGF-β1/Smad3/mmp2/mmp9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路