LncRNA AK054386吸附miR-199A-5p在肝臟IRI中對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用.pdf

1、研究目的：
　　肝臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury, IRI）是肝臟手術(shù)和肝移植中最常見、最嚴(yán)重也是最難于治療的問題，過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激又是IRI中極為關(guān)鍵的原因之一。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類具有基因調(diào)節(jié)功能的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可以通過識別3'-非編碼區(qū)(3'-uncoding region，3'UTR)與其靶向信使RNA(message RNA，mRNA)相結(jié)

2、合，降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯，降低蛋白水平。在占據(jù)人類基因組98.5％的非蛋白編碼序列中，絕大多數(shù)被轉(zhuǎn)錄成長度大于200個堿基的所謂“長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）”。LncRNA在多個層面上參與細(xì)胞分化和個體發(fā)育等重要生命過程的調(diào)控，并與人類的重大疾病密切相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)microRNA-199a-5p(miR-199a-5p)可以通過抑制過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而發(fā)揮肝臟保護(hù)作用

3、，并且發(fā)現(xiàn):當(dāng)肝臟IRI時，長鏈非編碼RNAAK054386(LncRNA AK054386)迅速上調(diào)，miRNA-199a-5p成熟體迅速下調(diào)而pri-miR-199a-5p初始體的水平不變。通過生物信息學(xué)分析，我們認(rèn)為兩者存在著密切聯(lián)系，但這是否為導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激失控的機(jī)制，正是本研究關(guān)注的問題。因此，我們擬利用小鼠肝臟IRI模型和小鼠胚胎肝細(xì)胞BCL CL.2缺氧/復(fù)氧模型，研究LncRNAAK054386、miR-199a-5p和

4、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子互相作用關(guān)系，明確LncRNAAK054386是如何調(diào)控肝細(xì)胞持續(xù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的，為肝臟IRI的機(jī)制及防治研究開拓新思路并奠定理論基礎(chǔ)。為明確相關(guān)機(jī)制，我們需要關(guān)注以下3個方面:
　　1.miR-199a-5p對肝臟IRI的影響及作用;
　　2.LncRNA AK054386對肝臟IRI的影響及作用;
　　3.LncRNA AK054386與miR-199a-5p相互作用的機(jī)制。
　　研

5、究方法：
　　1.TargetScan，miRanda數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析預(yù)測小鼠肝細(xì)胞LncRNA AK054386和miR-199a-5p的結(jié)合位點(diǎn)
　　2.建立C57BL/6小鼠肝臟IRI模型;
　　3.Real-time PCR檢測小鼠IRI模型中，肝細(xì)胞LncRNAAK054386和miR-199a-5p基因轉(zhuǎn)錄水平;
　　4.建立小鼠胚胎肝細(xì)胞（BNL CL.2細(xì)胞）缺氧/復(fù)氧模型;
　　5.BNL

6、CL.2細(xì)胞系轉(zhuǎn)染LncRNAAK054386過表達(dá)質(zhì)粒、LncRNA AK054386干擾質(zhì)粒、miR-199a-5p mimics和miR-199a-5p inhibitor，建立相應(yīng)的對照組;
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系在缺氧/復(fù)氧過程中的凋亡情況;
　　7.Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;
　　8.Real-time PCR檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染后正常培養(yǎng)條

7、件下的BNL CL.2細(xì)胞LncRNAAK054386、miR-199a-5p成熟體和初始體pri-miR-199a-5p的轉(zhuǎn)錄水平;
　　9.借助雙熒光素酶報告基因載體檢測LncRNAAK054386與miR-199a-5p的相互作用情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LncRNA AK054386與miR-199a-5p關(guān)系密切;
　　2.成功建立小鼠肝臟IRI模型;
　　3.小鼠肝臟IR

8、I模型中，miR-199a-5p水平在缺血時變化不明顯，再灌注后明顯下調(diào);
　　4.小鼠肝臟IRI模型中，LncRNA AK054386水平在缺血時有所上調(diào)，再灌注后顯著上調(diào);
　　5.體外成功建立BNL CL.2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型;
　　6.miR-199a-5p能夠在缺氧/復(fù)氧過程中對細(xì)胞起到保護(hù)作用;
　　7.LncRNA AK054386在缺氧/復(fù)氧過程中對細(xì)胞不起到直接作用，通過調(diào)控miR-199a-5

9、p間接阻斷其對細(xì)胞的保護(hù)作用;
　　8.LncRNA AK054386能夠降低miR-199a-5p成熟體的表達(dá)，對pri-miR-199a-5p初始體的表達(dá)無顯著影響;
　　9.雙熒光素酶報告基因證實:LncRNAAK054386直接作用于miR-199a-5p。
　　研究結(jié)論：
　　miR-199a-5p在肝臟IRI過程中可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)適度應(yīng)激保護(hù)肝細(xì)胞;但在再灌注過程中由于LncRNA AK054386的“