MiR-107在HepG2細胞耐受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中的作用.pdf

1、背景:原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。肝癌確診時往往已經(jīng)到了晚期,五年生存率只有7％左右。microRNAs(miRNAs或者miRs)為22個核苷酸左右的非編碼內(nèi)源性小分子RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控基因表達。miRNAs與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)誘導(dǎo)的細胞凋亡信號通路之間的相互調(diào)控是目前的研究熱點,miRNA

2、s既可以直接調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),同時它們的表達水平也受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)與正常肝細胞相比,肝癌細胞更容易對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生耐受,隨后應(yīng)用 miRNAs芯片技術(shù)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激前后的HepG2細胞進行miRNAs表達譜分析時發(fā)現(xiàn),miR-107水平顯著下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn),人類許多的腫瘤中都有 miR-107的表達異常,與腫瘤的生物學(xué)行為,如增殖、凋亡、細胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。本研究將在前期工作的基礎(chǔ)上,利用PCR

3、技術(shù)進一步驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否會影響HepG2細胞內(nèi)miR-107的表達水平,進而了解miR-107在HepG2細胞耐受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中的作用,以期為肝癌的治療尋找新的方法。
　　目的:研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對HepG2細胞內(nèi)miR-107表達水平的影響,并探討miR-107在HepG2細胞耐受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中的作用。
　　方法:
　　1.應(yīng)用3μmol/L的衣霉素(tunicamycin,TM)誘導(dǎo)HepG

4、2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,采用qRT-PCR法檢測未經(jīng)衣霉素處理及衣霉素處理24 h后人肝癌細胞株HepG2內(nèi)miR-107表達水平的差異。
　　2.應(yīng)用Lipofectamine2000將miR-107 mimics及miR-107 inhibitor轉(zhuǎn)染入HepG2細胞中。轉(zhuǎn)染24 h后,通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的效率。
　　3.采用qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染miR-107 mimics及miR-107 inhibitor24 h后

5、HepG2細胞內(nèi)miR-107表達水平的變化。
　　4.四甲基偶氮唑藍(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法檢測上調(diào)或下調(diào)miR-107的表達對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下的HepG2細胞增殖的影響。
　　5.流式細胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)檢測上調(diào)或下調(diào)miR-107的表達對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下的HepG2細胞凋亡的影響。

6、r>　　結(jié)果:
　　1.qRT-PCR結(jié)果顯示,衣霉素處理24 h后,miR-107在HepG2細胞內(nèi)表達下調(diào),其表達水平為未處理組的(0.39±0.05)倍。
　　2.轉(zhuǎn)染24 h后于熒光顯微鏡下觀察,可見miR-107 mimics組及miR-107 inhibitor組HepG2細胞的轉(zhuǎn)染效率均達90%。
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染24 h后miR-107 mimics組HepG2細胞內(nèi)miR-107表

7、達水平顯著高于空白對照組,約為空白對照組的(72.27±3.57)倍;miR-107 inhibitor組 HepG2細胞內(nèi) miR-107表達水平顯著低于空白對照組,約為空白對照組的(0.07±0.02)倍。
　　4.MTT法結(jié)果顯示,衣霉素及miR-107 mimics聯(lián)合處理組的HepG2細胞增殖抑制率顯著高于衣霉素單獨處理的細胞,衣霉素及miR-107 inhibitor聯(lián)合處理組的HepG2細胞增殖抑制率顯著低于衣霉素單

8、獨處理的細胞。
　　5.FCM結(jié)果顯示,衣霉素及miR-107 mimics聯(lián)合處理組的HepG2細胞凋亡率顯著高于衣霉素單獨處理的細胞,衣霉素及miR-107 inhibitor聯(lián)合處理組的HepG2細胞凋亡率顯著低于衣霉素單獨處理的細胞。
　　結(jié)論:
　　1.miR-107在HepG2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時表達下調(diào)。
　　2.上調(diào)miR-107的表達水平能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下的HepG2細胞增殖,促進細胞凋亡。<