miR-346在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬中的作用及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或者錯(cuò)誤折疊蛋白的累積將導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Edoplasmic Reticulum Stress, ERS）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Response, UPR），嘗試恢復(fù)正常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。ERS引起的UPR參與多種人類疾病的病理生理過程，包括神經(jīng)退行性疾病、糖尿病以及腫瘤等。已有研究表明細(xì)胞自噬和微小 RNA（microRNA， miRNA）

2、參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)節(jié)，但是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中miRNA是否參與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)還不是很清楚。我們發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的條件下 miR-346的表達(dá)顯著增加，并且 miR-346可以顯著提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下細(xì)胞的活性。在此基礎(chǔ)上我們探討 miR-346在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下促進(jìn)細(xì)胞存活的機(jī)制，及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下 miR-346在細(xì)胞自噬和線粒體自噬過程中的作用及其分子機(jī)制。
　　方法：首先，我們建立了毒胡蘿卜素（Thapsiga

3、rgin, Tg）誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，并通過western blot或者RT-qPCR的方法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78或者XBP-1(U)與XBP-1(S) mRNA的表達(dá)情況來判斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否誘導(dǎo)成功；通過RT-qPCR的方法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下miR-346的表達(dá)情況；通過MTT和Annexin V-FITC/PI法分別檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下miR-346對(duì)細(xì)胞活性以及凋亡的影響。其次，我們通過GFP-LC3示蹤實(shí)驗(yàn)

4、、western blot檢測(cè)LC3-I以及LC3-II表達(dá)等探討了miR-346對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)；通過GFP-LC3聯(lián)合MitoTracker? Red CMXRos染色探討miR-346對(duì)線粒體自噬的調(diào)節(jié)；通過活性氧敏感探針 DCFH-DA研究 miR-346對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下活性氧的調(diào)節(jié)。而后，我們通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，并通過western blot、RT-qPCR以及熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下 miR-3

5、46靶基因，并進(jìn)一步研究了靶基因的功能。最后我們通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀、蛋白質(zhì)泛素化分析的方法探討miR-346促進(jìn)細(xì)胞自噬的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的條件下 miR-346的表達(dá)水平顯著增加，XBP-1參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下 miR-346的表達(dá)調(diào)節(jié)，并且miR-346可以顯著降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下細(xì)胞的凋亡水平從而提高細(xì)胞的活性。miR-346可以顯著增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下細(xì)胞的自噬和線粒體自噬水平，降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平

6、；miR-346通過自噬依賴的方式提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下細(xì)胞的活性。miR-346直接靶定并上調(diào)GSK3B的表達(dá)；過表達(dá) GSK3B可以顯著增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下細(xì)胞的自噬，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧水平降低以及細(xì)胞活性增強(qiáng)，而敲降GSK3B則相反；功能挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)GSK3B是miR-346的直接功能靶基因。miR-346和GSK3B可以顯著增加BCL2的泛素化水平，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的BCL2蛋白水平顯著降低，促進(jìn)BCL2與BECN1的解離。
　　結(jié)