Twist1在骨髓瘤中的表達(dá)及其作用的實驗研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤（MM）是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，以單克隆漿細(xì)胞惡性增殖并分泌大量單克隆免疫球蛋白為特征，骨髓瘤患者易發(fā)生髓外浸潤，累及軟組織，晚期可有廣泛性轉(zhuǎn)移，較多見于脊柱，患者預(yù)后極差。Twist1是屬于基本螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）蛋白家族的一種轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育，尤其是中胚層的形成及分化中發(fā)揮著重要作用。此外， Twist1在腫瘤細(xì)胞增殖、衰老凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transi

2、tion,EMT）、腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞樣細(xì)胞的形成、血管新生、腫瘤細(xì)胞耐藥等方面發(fā)揮重要作用。研究證明在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等上皮性腫瘤以及膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、惡性黑色素瘤、急性髓系白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、部分惡性淋巴瘤等非上皮性腫瘤中，發(fā)現(xiàn) Twist1高表達(dá)，且其表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后不良相關(guān)。在癌中，Twist1通過減弱上皮性基因的表達(dá)，增強(qiáng)間葉源性基因的表達(dá)，導(dǎo)致上皮間

3、質(zhì)轉(zhuǎn)化，使上皮細(xì)胞獲得運動、遷移等間葉細(xì)胞的特征，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、多種基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子和趨化因子等構(gòu)成。IL-6、TNFα是兩種最重要的炎癥細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤患者血液及骨髓中含有異常升高的IL-6和TNFα，并與腫瘤的復(fù)發(fā)、進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。在人惡性黑色素瘤細(xì)胞系WM-266-4中，IL-6能激活STAT3，使其磷酸化，導(dǎo)致Tw

4、ist1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而 Twist的下游蛋白N-cadherin表達(dá)也增高。最終，腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲力，易發(fā)生轉(zhuǎn)移。在乳腺癌中，TNFα依賴NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子Twist1上調(diào)，誘發(fā)EMT，促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤和血管新生。
　　目前，關(guān)于 Twist1是否在骨髓瘤中表達(dá)及其意義，以及炎性細(xì)胞因子IL-6和TNFα是否影響Twist1的表達(dá)，相關(guān)研究尚未見報道。探討Twist1是否參與骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展及其作用機(jī)制，對于骨髓瘤的

5、預(yù)后評估及治療具有重要意義。
　　因此，本研究旨在探討 Twist1在骨髓瘤中的表達(dá)及其意義，研究論文分為三部分，第一部分：檢測骨髓瘤患者骨髓及髓外病變組織中Twist1的表達(dá)及其預(yù)后意義。第二部分：在人骨髓瘤細(xì)胞系中過表達(dá)Twist1，觀察其生物學(xué)行為的變化。第三部分：IL-6、TNFα對Twist1表達(dá)的影響。通過以上研究，探討 Twist1在骨髓瘤進(jìn)展中的作用及可能機(jī)制，為骨髓瘤的靶向治療提供理論依據(jù)。
　　第一部分

6、Twist1在多發(fā)性骨髓瘤合并骨的髓外病變患者中的表達(dá)及意義
　　目的：通過檢測多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）合并骨的髓外病變（extramedullary disease，EMD）患者骨髓組織和局部病變組織中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist1及ZEB1的表達(dá)情況，分析它們與臨床各指標(biāo)之間的關(guān)系，進(jìn)而闡明EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在MM合并骨EMD患者中的的臨床意義。
　　方法：
　　1采取免疫組化的方法

7、，檢測Twist1和ZEB1在70例MM合并骨EMD患者的EMD組織、骨髓以及33例不合并EMD患者的骨髓組織瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　2采用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法計數(shù)骨髓組織和EMD組織中的微血管密度。
　　結(jié)果：
　　1 Twist1在MM合并骨EMD患者的EMD組織中骨髓瘤細(xì)胞核上的陽性表達(dá)率為24.3％（17/70），顯著高于其骨髓組織以及不合并EMD患者的骨髓組織，差

8、別具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(分別為P=0.030和P=0.011)。
　　2 ZEB1的陽性表達(dá)率在MM不合并骨EMD組織患者的骨髓、合并骨EMD患者的骨髓以及骨EMD組織中分別為30.0%(9/30)、30.3%(10/33)和45.7%(32/70)。ZEB1的陽性表達(dá)率在骨EMD組織和二種骨髓中均無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.185和P=0.197）。
　　3 Spearman相關(guān)分析顯示，骨EMD組織中骨髓瘤細(xì)胞核Twist1和Z

9、EB1的表達(dá)之間呈正相關(guān)（r=0.350, P=0.003）。Twist1高表達(dá)組微血管密度（microvessel density，MVD）顯著高于Twist1低表達(dá)組(P=0.004)。然而， ZEB1高表達(dá)組和 ZEB1低表達(dá)組之間 MVD無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.623)。
　　4 Twist1高表達(dá)組的無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）顯著低于Twist1低表達(dá)組(11.8%vs.35

10、.0%, P=0.000)，Twist1高表達(dá)組的總生存期（overall survival，OS）顯著低于Twist1低表達(dá)組(52.5%vs.83.7%, P=0.001)。多因素分析顯示，Twist1高表達(dá)是預(yù)測短 PFS(HR=2.161;95%CI:1.116-4.183; P=0.022)和 OS(HR=3.111;95%CI:1.114-8.685;P=0.030)的獨立預(yù)后指標(biāo)。單因素分析中ZEB1的高表達(dá)只與三年OS有

11、關(guān)。
　　綜合以上實驗結(jié)果：Twist1在MM合并骨EMD患者的EMD組織中陽性表達(dá)率顯著高于其骨髓組織以及不合并EMD患者的骨髓組織。Twist1高表達(dá)是MM合并骨EMD患者的不良預(yù)后指標(biāo)，且Twist1的表達(dá)可能與MM合并骨EMD的血管新生有關(guān)。
　　第二部分 Twist1過表達(dá)對骨髓瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：上一部分研究發(fā)現(xiàn) Twist1在骨髓瘤中的表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)。但 Twist1在骨髓瘤發(fā)生、進(jìn)

12、展中具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染人骨髓瘤細(xì)胞，建立穩(wěn)定過表達(dá) Twist1的腫瘤細(xì)胞株，全面觀察腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，進(jìn)而探討 Twist1在骨髓瘤進(jìn)展中的作用。
　　方法：
　　1利用慢病毒轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞 RPMI8226、LP1，建立穩(wěn)定過表達(dá)Twist1基因的細(xì)胞株。
　　2采用Western Blot和Real-time PCR方法驗證Twist1過表達(dá)效果。
　　3 CCK-8法檢測twi

13、st1過表達(dá)后骨髓瘤細(xì)胞增殖情況。
　　4采用FCM技術(shù)分析Twist1過表達(dá)后骨髓瘤細(xì)胞凋亡變化。
　　5 Transwell小室遷移實驗觀察腫瘤細(xì)胞Twist1過表達(dá)后遷移能力改變。
　　6采用ELISA和Western Blot方法檢測骨髓瘤細(xì)胞過表達(dá)Twist1后VEGF的分泌及表達(dá)情況。
　　7采用Western Blot方法檢測Twist1過表達(dá)后骨髓瘤細(xì)胞EMT相關(guān)基因蛋白Vimentin、E-ca

14、dherin、N-cadherin的表達(dá)變化。
　　8 CCK-8法檢測Twist1過表達(dá)后骨髓瘤細(xì)胞對硼替佐米敏感性的影響。
　　結(jié)果：
　　1慢病毒轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定過表達(dá)Twist1的人骨髓瘤細(xì)胞株
　　含有表達(dá) Twist1的慢病毒顆粒及陰性對照慢病毒顆粒分別感染人骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226、LP1，嘌呤霉素藥篩后，熒光倒置顯微鏡下觀察，90%以上腫瘤細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。
　　2轉(zhuǎn)染效果

15、鑒定
　　qRT-PCR和western-blot檢測發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226和LP1后，與空白對照及陰性對照組相比，Twist1基因在mRNA和蛋白水平上都明顯上調(diào)(P<0.05)。
　　3 Twist1過表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力
　　用CCK8檢測細(xì)胞增殖，兩種細(xì)胞的Twist1過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力與各自陰性對照組相比都明顯增強(qiáng)(P<0.05)。
　　4 Twist1過表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡

16、>　　流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，8226-Twist1組細(xì)胞總凋亡率（2.98±0.41）%與8226-NC組總凋亡率（7.14±0.47）%相比，細(xì)胞凋亡明顯減少(P<0.01)。同樣，與 LP1-NC組總凋亡率（4.27±0.34）%相比， LP1-Twist1組（1.76±0.32）%細(xì)胞凋亡明顯減少(P<0.01)。這說明Twist1過表達(dá)能抑制骨髓瘤細(xì)胞的凋亡。
　　5 Twist1過表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力
　　Tra

17、nswell小室遷移實驗通過計數(shù)各組穿膜細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，8226-NC組，8226-Twist1組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為，58.00±6.56,102.33±12.58。LP1-NC組， LP1-Twist1組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為67.00±5.00,125.33±9.61，無論8226還是LP1細(xì)胞，Twist1過表達(dá)組與各自陰性對照組比，穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯增加，細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)。
　　6 Twist1過表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞V

18、EGF的表達(dá)
　　ELISA試劑盒測定細(xì)胞上清VEGF濃度，western-blot檢測細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與各自陰性對照組相比，Twist1過表達(dá)組骨髓瘤細(xì)胞VEGF的分泌明顯增多，腫瘤細(xì)胞 VEGF蛋白表達(dá)亦明顯增強(qiáng)，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。
　　7 Twist1過表達(dá)對EMT相關(guān)蛋白的影響
　　Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照及陰性對照相比，骨髓瘤細(xì)胞Twist1過表達(dá)后上皮性標(biāo)

19、志物 E-cadherin表達(dá)下降，間葉性標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin表達(dá)增強(qiáng)。提示Twist1過表達(dá)可引起EMT樣作用。
　　8 Twist1過表達(dá)后腫瘤細(xì)胞對硼替佐米的敏感性下降
　　用CCK8檢測硼替佐米對各組細(xì)胞的抑制率，求得 IC50。當(dāng)藥物濃度為10nM時，硼替佐米對兩種腫瘤細(xì)胞 Twist1過表達(dá)組和陰性對照組的抑制率無明顯差別，但當(dāng)藥物濃度達(dá)到20nM及以上時，硼替佐米對Twist1過表達(dá)組腫

20、瘤細(xì)胞的抑制率比各自陰性對照組明顯降低（P<0.05）。8226-NC組與8226-Twist1組的 IC50分別為21.63±2.30 nmol/L vs28.63±8.52 nmol/L。LP1-NC組及 LP1-Twist1組的 IC50分別為25.59±4.07nmol/L vs29.55±11.32nmol/L。與各自對照組相比，Twist1過表達(dá)組的IC50均明顯增高。實驗結(jié)果表明硼替佐米對Twist1過表達(dá)組腫瘤細(xì)胞的抑制

21、率降低，Twist1過表達(dá)可減弱腫瘤細(xì)胞對硼替佐米的敏感性，產(chǎn)生化學(xué)抗性。
　　綜合以上結(jié)果，慢病毒轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞過表達(dá) Twist1基因后，腫瘤細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡減少，遷移能力增加，骨髓瘤細(xì)胞 VEGF的表達(dá)增加，對化療藥物硼替佐米的敏感性降低。另一方面，Twist1過表達(dá)引起EMT相關(guān)基因蛋白E-cadherin的表達(dá)減少，Vimentin、N-cadherin表達(dá)增加，誘發(fā) EMT，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移。Twist1

22、基因是骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生EMT樣作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
　　第三部分 TNFα、IL-6對Twist1表達(dá)的影響
　　目的：我們在第一部分研究發(fā)現(xiàn)，合并EMD的骨髓瘤患者高表達(dá)Twist1基因，并且與不良預(yù)后相關(guān)。第二部分體外研究骨髓瘤細(xì)胞過表達(dá)Twist1后，可通過提高細(xì)胞增殖、遷移、減少凋亡，促進(jìn)血管新生、EMT樣作用和降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性等促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。但骨髓瘤患者腫瘤細(xì)胞高表達(dá)Twist1從何而來，受什么

23、因素調(diào)節(jié)，目前尚不清楚。既往研究發(fā)現(xiàn)骨髓瘤患者血清和骨髓液中TNFα、IL-6水平異常升高，并且與腫瘤的復(fù)發(fā)、進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。為明確骨髓瘤腫瘤微環(huán)境中TNFα、IL-6和Twist1表達(dá)之間的關(guān)系，本部分實驗通過TNFα、IL-6刺激骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226，檢測Twist1、EMT相關(guān)基因、NF-κBp65、p-NF-κBp65、STAT3、p-STAT3的表達(dá)變化，明確TNFα、IL-6對Twist1表達(dá)的影響及可能機(jī)制。

24、r>　　方法：
　　1采用Western Blot方法檢測 TNFα、IL-6刺激骨髓瘤細(xì)胞對twist1表達(dá)的影響
　　取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×105個/ml的濃度接種于6孔板，分別以0、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml濃度的IL-6或TNFα處理細(xì)胞24h后提取蛋白，采用Western Blot方法檢測 Twist1的表達(dá)變化。
　　2采用Western Blot方法檢測TNFα、IL-6刺激骨髓瘤細(xì)

25、胞對EMT相關(guān)蛋白、NF-κB p65、STAT3蛋白表達(dá)及磷酸化水平的影響。
　　取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×105個/ml的濃度接種于6孔板，以40ng/ml濃度的IL-6或TNFα處理細(xì)胞24h后提取蛋白，采用Western Blot方法檢測Twist1、E-cadherin、Viemntin、N-cadherin、核NF-ΚB p65、p-NF-ΚB p65、STAT3、p-STAT3表達(dá)變化。
　　3采用Western

26、 Blot方法檢測NF-ΚB抑制劑預(yù)處理后，TNFα刺激骨髓瘤細(xì)胞對Twist1表達(dá)的影響。
　　取對數(shù)生長期細(xì)胞，100μM PTDC(NF-κB抑制劑)預(yù)處理2h,移去PTDC，更換新的1640培養(yǎng)基，再給予TNFα至終濃度40ng/ml，24 h后收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，用 Western blot檢測 Twist1的表達(dá)變化。
　　4采用Western Blot方法檢測STAT3抑制劑預(yù)處理后， IL-6刺激骨髓瘤細(xì)胞

27、對twist1表達(dá)的影響。
　　取對數(shù)生長期細(xì)胞，1μM Cpd188(SATAT3抑制劑)預(yù)處理1h,移去Cpd188，更換新的1640培養(yǎng)基，再給予IL-6至終濃度40ng/ml，24 h后收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，用 Western blot檢測 Twist1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1 TNFα、IL-6可提高骨髓瘤細(xì)胞Twist1蛋白的表達(dá)
　　Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，以不同濃度 TNFα、I

28、L-6刺激骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226，都能增加Twist1的蛋白表達(dá)，并且隨著IL-6、TNFα濃度的增加，Twist1蛋白表達(dá)逐步增強(qiáng)，有量效依賴關(guān)系。
　　2 Twist1參與TNFα、IL-6引發(fā)的EMT樣作用
　　TNFα、IL-6刺激RPMI8226細(xì)胞后，間葉組織標(biāo)志物Viemntin、Twist1、N-cadherin升高，而上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin則表達(dá)降低，提示TNFα、IL-6引發(fā)EMT樣作用，

29、促進(jìn)骨髓瘤的進(jìn)展，Twist1蛋白參與其中。
　　3 TNFα通過激活NF-κB信號通路，上調(diào)Twist1的表達(dá)。
　　TNFα刺激RPMI8226細(xì)胞， p-NF-κB p65、細(xì)胞核中NF-κB p65、Twist1蛋白表達(dá)均升高；先用NF-κB抑制劑PTDC預(yù)處理RPMI8226細(xì)胞，再加TNFα刺激，發(fā)現(xiàn) Twist1蛋白表達(dá)減少。提示TNFα可能是通過激活 NF-κB信號通路，上調(diào)Twist1的表達(dá)。
　　4

30、 IL-6通過激活STAT3信號通路，上調(diào)Twist1的表達(dá)。
　　IL-6刺激RPMI8226細(xì)胞，STAT3蛋白表達(dá)減少，P-STAT3、Twist1蛋白表達(dá)升高；先用p-STAT3抑制劑 Cpd188預(yù)處理RPMI8226細(xì)胞，再加 IL-6刺激，發(fā)現(xiàn) Twist1蛋白表達(dá)減少。提示 IL-6可能是通過激活STAT3信號通路，上調(diào)Twist1的表達(dá)。
　　綜合以上結(jié)果，TNFα、IL-6刺激骨髓瘤細(xì)胞 RPMI8226

31、均能增加Twist1的表達(dá)。TNFα、IL-6分別通過NF-κB、STAT3信號通路，上調(diào)Twist1的表達(dá)，引發(fā)EMT，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。
　　結(jié)論：
　　1 Twist1在MM合并骨EMD患者EMD組織中的陽性表達(dá)率顯著高于其骨髓組織以及不合并EMD患者的骨髓組織。Twist1的表達(dá)與腫瘤組織MVD呈正相關(guān)。多因素分析發(fā)現(xiàn)，Twist1高表達(dá)是骨髓瘤合并EMD患者的獨立預(yù)后指標(biāo)。
　　2骨髓瘤細(xì)胞過表達(dá)Twist1后

32、，細(xì)胞增殖能力、遷移能力增強(qiáng)，凋亡減少，對硼替佐米的敏感性降低，引起骨髓瘤細(xì)胞 VEGF的表達(dá)增加。另一方面，Twist1過表達(dá)引發(fā)EMT樣作用，Twist1基因是骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生EMT樣作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。為靶向下調(diào)Twist1，抑制骨髓瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移及腫瘤耐藥提供理論依據(jù)。
　　3 TNFα、IL-6均能提高骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226中 Twist1蛋白的表達(dá)。
　　4 TNFα、IL-6分別通過NF-κB、STAT3