Twist1基因在白血病細(xì)胞中的表達(dá)及其意義.pdf

1、1、Twist1基因是1987年Thisse B等首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因，它屬于堿性的螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，進(jìn)化過程中非常保守，在不同種屬之間其核苷酸和氨基酸序列高度保守，在胚胎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。此外Twist1被認(rèn)為是癌基因，影響腫瘤細(xì)胞凋亡，而且作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial.Mesenchymal transition，EMT）過程中的關(guān)

2、鍵調(diào)控因子，Twist1對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要影響。Twist1可參與多種細(xì)胞的分化，包括肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨原細(xì)胞，并與心瓣膜的發(fā)育有關(guān)。Twist1的缺失或突變會導(dǎo)致尖頭-并指畸形綜合癥。到目前為止，其促腫瘤作用及其與分化關(guān)系的報(bào)道多局限于實(shí)體瘤，在造血系統(tǒng)中鮮有報(bào)道。
　　 我們首先采用Real-time PCR方法檢測了187例白血病患者（106例初治患者，9例治療后CR患者），7例MDS患者，29例ITP患者及3例正

3、常人骨髓，3例正常人外周血中Twist1基因的表達(dá)情況。CML、AML患者同ITP及正常人相比，Twist1表達(dá)明顯升高（p<0.05）；ALL患者同ITP患者相比，Twist1表達(dá)量沒有明顯變化（p>0.05）。Twist1 mRNA表達(dá)水平與患者性別，年齡，外周血WBC，是否表達(dá)CD34抗原等均未顯示出明顯的相關(guān)性（p>0.05）。
　　 無論相對于正常人還是其他白血病類型，CML、AML患者均顯示出了Twist1高表達(dá)趨勢

4、。AML患者中，M2，M3，M5患者的Twist1表達(dá)中位數(shù)顯著高于ITP及正常人（p<0.05）。AML進(jìn)展期患者表達(dá)中位數(shù)明顯高于治療后CR患者0.5540（0.0060-79.90）verse0.0620（0.0290-1.180），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.0249）。將白血病患者Twist1表達(dá)水平與患者細(xì)胞遺傳學(xué)異常進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)，伴有t（8；21）的M2患者中，Twist表達(dá)中位數(shù)0.0390（0.0270-0.7

5、060）反而較正常人0.2250（0.002-2.803）有所降低（p>0.05），并顯著低于AML-ETO陰性的M2患者0.0390（0.0270-0.7060），（p<0.05）。PML/RARa陽性患者表達(dá)中位數(shù)0.5785（0.0360-13.16），低于陰性患者表達(dá)（1.0070（0.0370-31.14），但差異不顯著（p>0.05）。在M3患者中，初治患者Twist1 mRNA表達(dá)明顯高于治療后CR患者表0.6755（0.

6、0360-31.14）verse0.1110（0.0380-7.282），但沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。在CML患者中，BCR/ABL表達(dá)陽性患者的Twist1表達(dá)中位數(shù)0.5330（0.0290-9.349）明顯高于BCR/ABL陰性患者0.8000（0.0060-29.34），并具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　 由于大量臨床標(biāo)本的檢測采用的是Real-time PCR方法測mRNA水平，是否代表蛋白水平表達(dá)

7、尚不清楚。我們?nèi)?例ITP患者、7例ALL患者、8例CML患者、11例AML患者共33例病人的骨髓標(biāo)本，用Real-time PCR和免疫組織化學(xué)方法同時(shí)檢測Twist1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，并進(jìn)行兩者的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示Twist1在mRNA水平的表達(dá)和在蛋白水平的表達(dá)具有明顯相關(guān)性（y=0.01959 x-0.1580，p=0.0211）。提示，Real-Time PCR檢測Twist1 mRNA表達(dá)，完全可以代表蛋白表達(dá)水

8、平。
　　 上述結(jié)果提示，Twist1可能在CML、AML尤其是在BCR/ABL陽性、AML-ETO陰性和PML/RARa陰性白血病的發(fā)生和發(fā)展中有重要的作用。
　　 2、在前期工作中我們發(fā)現(xiàn)，在K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mda-7/IL-24，可以使Twist1表達(dá)大幅度下降，而mda-7/IL-24與細(xì)胞的分化有著密不可分的關(guān)系，在TPA誘導(dǎo)HL60、U937分化過程中mda-7/IL-24表達(dá)上調(diào)，并在TPA誘導(dǎo)分化中起重

9、要作用。由于K562細(xì)胞高表達(dá)Twist1基因，為了研究Twist1與白血病細(xì)胞分化及mda-7/IL-24的關(guān)系，我們選取了K562細(xì)胞系用TPA誘導(dǎo)細(xì)胞分化，分別于24h、48h、72h用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法檢測分化過程中mda-7/IL-24與Twist1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TPA處理的K562細(xì)胞隨著巨核系分化，出現(xiàn)mda-7/IL-24表達(dá)的大幅上調(diào)，同時(shí)，Twist1表達(dá)有下降趨勢，提示mda-7/

10、IL-24可能通過下調(diào)Twist1表達(dá)，促進(jìn)TPA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞分化。用siRNA干擾K562細(xì)胞中mda-7/IL-24的表達(dá)，同時(shí)加TPA處理，檢測Twist1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Twist1 mRNA表達(dá)下降，進(jìn)一步證實(shí)了mda-7/IL-24與Twist1的關(guān)系。為進(jìn)一步證明Twist1與分化的關(guān)系，我們構(gòu)建了pcDNA3.1/myc-His（-）B-twist1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，篩選出表達(dá)Twist1的穩(wěn)定細(xì)胞株，以期在