BDNF-TrkB異常表達(dá)在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病中的作用及機(jī)理研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(MM)是骨髓內(nèi)異常漿細(xì)胞克隆性增殖性疾病。盡管近年來MM的基礎(chǔ)和臨床研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是迄今為止，MM仍然是不能根治的惡性血液系統(tǒng)疾病。深入探討MM發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制，進(jìn)行特異性、靶向性治療是血液病研究工作者面臨的挑戰(zhàn)。近年來研究表明骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞因子及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活中起重要作用，與骨髓瘤疾病的形成和惡化密切相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)MM患者血漿中BDNF高表達(dá)，而且BDNF表達(dá)水平與疾病進(jìn)展程

2、度相關(guān)。為了進(jìn)一步研究BDNF/TrkB與MM發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本的檢測(cè)初步研究了BDNF及其受體TrkB和p75NTR在骨髓瘤細(xì)胞系和骨髓瘤患者細(xì)胞中的表達(dá)；進(jìn)而對(duì)BDNF的體內(nèi)外促血管新生作用進(jìn)行了初步研究并進(jìn)一步探討B(tài)DNF與MM誘導(dǎo)的血管新生的關(guān)系；并且通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)觀察BDNF對(duì)MM細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和化療耐藥的作用；深入了解BDNF/TrkB信號(hào)參與MM的病理過程。 第一部分 腦

3、源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá) 背景和目的：腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一員，對(duì)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)多種類型神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和再生具有重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)BDNF通過激活其高親和力TrkB受體參與多種神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。最新資料顯示，BDNF和/或其受體TrkB異常表

4、達(dá)也可見于血液系統(tǒng)腫瘤包括多發(fā)性骨髓瘤。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MM患者血漿中BDNF高表達(dá)，而且BDNF表達(dá)水平與疾病進(jìn)展程度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本的檢測(cè)初步研究了BDNF和其受體在骨髓瘤細(xì)胞系和骨髓瘤患者中的表達(dá)，旨在探討B(tài)DNF/TrkB作為MM治療的新的靶分子的可行性。 方法：分離培養(yǎng)MM患者原代骨髓瘤細(xì)胞，RT-PCR法、Western-blot法分別檢測(cè)MM細(xì)胞系(HMCLs)RPMI8226、U266、KM3細(xì)胞和

5、原代骨髓瘤細(xì)胞BDNF及其受體TrkB和p75NTR在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)HMCLsBDNF的分泌水平；免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)16例MM患者和9例對(duì)照骨髓活檢切片中BDNF及其受體TrkB的表達(dá)。 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果表明12例MM患者原代漿細(xì)胞和HMCLsRPMI-8226、U266、KM3不僅表達(dá)BDNFmRNA，也表達(dá)其高親和力酪氨酸激酶受體TrkBmRNA；而正常人外周血B淋巴細(xì)胞不表達(dá)BDNF和

6、TrkBmRNA。Western-blotting分析證實(shí)HMCLs亦表達(dá)BDNF和TrkB蛋白，ELISA法檢測(cè)HMCLs上清液中BDNF蛋白的基礎(chǔ)分泌水平分別為(14.7±2.4)ng/ml、(8.2±1.3)ng/ml、(13.2±1.2)ng/ml，明顯高于正常人類血漿中BDNF(2.0±0.6)ng/ml的水平。骨髓活檢16例MM患者有12例瘤細(xì)胞BDNF陽(yáng)性表達(dá)，15例TrkB陽(yáng)性表達(dá)，表現(xiàn)為彌散的胞漿染色；而9例對(duì)照組正常

7、造血細(xì)胞僅有2例和4例弱陽(yáng)性表達(dá)。在HMCLs、MM患者原代漿細(xì)胞和MM患者骨髓活檢切片中，RT-PCR、Westernblotting和免疫組化染色均未檢測(cè)到BDNF的低親和力受體p75NTR的表達(dá)。 結(jié)論：MM中存在著BDNF及其受體TrkB的異常表達(dá)，BDNF可能通過多種機(jī)制參與MM的病理生理過程，有望成為骨髓瘤治療的新靶點(diǎn)。 第二部分 BDNF對(duì)多發(fā)性骨髓瘤血管新生作用的研究 背景和目的：血管新生

8、參與多發(fā)性骨髓瘤(MM)的病理生理過程，與MM的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。骨髓瘤細(xì)胞可直接分泌多種作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的促血管新生因子，在骨髓瘤血管新生中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MM中存在著BDNF異常高表達(dá)，而且MM患者血清BDNF表達(dá)水平和一種重要的促血管新生因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)平行并有一定的相關(guān)性。最新資料顯示人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞(HCEC)等多種內(nèi)皮細(xì)胞以及新生血管平滑肌細(xì)胞均能產(chǎn)生BDNF，并

9、且發(fā)現(xiàn)BDNF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的支持作用，推測(cè)BDNF可能在一定程度上參與了機(jī)體新生血管的形成。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)BDNF的體內(nèi)外促血管新生作用進(jìn)行了初步研究并進(jìn)一步探討人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系BDNF的表達(dá)與MM誘導(dǎo)的血管新生的關(guān)系。 方法：分離并培養(yǎng)原代HUVEC，采用四唑鹽(MTT)比色法觀察BDNF對(duì)HUVEC增殖的作用，用改良的Boyden小室法和體外小管形成實(shí)驗(yàn)等體外血管新生模型觀察不同濃度BDNF對(duì)HUV

10、EC遷移和形成血管通道的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用雞胚尿囊膜血管生成實(shí)驗(yàn)和小鼠Matrigelplug方法。制備KM3、RPMI-8826骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加或不加抗人類BDNF中和抗體，然后再分別用MTT法、改良的Boyden小室法和體外小管形成實(shí)驗(yàn)觀察不同體積分?jǐn)?shù)骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)HUVEC增殖、遷移和分化的影響。 結(jié)果：BDNF對(duì)HUVEC的增殖沒有顯著作用，但可明顯促進(jìn)HUVEC的遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成。BDNF以濃度依賴性

11、方式誘導(dǎo)HUVEC遷移，HUVEC的遷移指數(shù)25ng/mlBDNF為1.24±0.18，50ng/mlBDNF為1.56±0.23，100ng/mlBDNF為1.89±0.29，100ng/mlBDNF的遷移指數(shù)與25ng/mlVEGF相當(dāng)。100ng/mlBDNF處理后，二維基質(zhì)膠中HUVEC形成完整的管狀結(jié)構(gòu)，小管的直徑及面積均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。BDNF亦可明顯促進(jìn)小鼠Matrigelplug中血管新生和雞胚尿囊膜血管

12、生成。另一方面，KM3、RPMI8226培養(yǎng)上清液均可明顯促進(jìn)HUVEC增殖，含50.0％KM3培養(yǎng)上清液組和完全KM3培養(yǎng)上清液組HUVEC數(shù)均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，抗人類BDNF中和抗體可部分抑制其促增殖活性；MM細(xì)胞系培養(yǎng)上清液對(duì)HUVEC的遷移和分化亦有明顯的促進(jìn)作用，含50.0％KM3培養(yǎng)上清液組HUVEC遷移指數(shù)為1.85±0.23(P＜0.05)，完全KM3培養(yǎng)上清液組HUVEC遷移指數(shù)為2.16±0.29(P＜

13、0.05)，并可明顯促進(jìn)基質(zhì)膠中網(wǎng)狀毛細(xì)血管形成(P＜0.01)，抗BDNF中和抗體可明顯抑制其作用。 結(jié)論：BDNF在體內(nèi)外均具有明顯的促血管新生作用，可能為一種新的促血管新生因子；骨髓瘤細(xì)胞異常表達(dá)和分泌的BDNF可能參與骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生。 第三部分 BDNF激活TrkB受體促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖和遷移的實(shí)驗(yàn)研究 背景和目的：研究表明MM的轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在骨髓，骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞因子及其介導(dǎo)的信號(hào)通

14、路在骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活中起重要作用，與骨髓瘤疾病的形成和惡化密切相關(guān)。MM中存在著BDNF及其高親和力酪氨酸激酶受體TrkB的異常表達(dá)，近年來研究發(fā)現(xiàn)BDNF/TrkB在調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、遷移和侵襲過程中起重要作用，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)BDNF對(duì)MM細(xì)胞增殖遷移和化療保護(hù)的作用進(jìn)行了初步研究，旨在探討B(tài)DNF/TrkB與MM發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法：分離培養(yǎng)MM患者原代骨髓瘤細(xì)胞，采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)BDNF對(duì)H

15、MCLs(RPMI8226、U266、KM3)和原代MM細(xì)胞的存活促進(jìn)作用，[3H]脫氧胸苷(3H-dTR)摻入法測(cè)定BDNF對(duì)MM細(xì)胞增殖的影響，用改良的Boyden小室法觀察BDNF對(duì)骨髓瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響，用MTT比色法觀察BDNF對(duì)馬法蘭和長(zhǎng)春新堿細(xì)胞毒作用的影響，用Westernblotting檢測(cè)BDNF對(duì)MM細(xì)胞TrkB受體磷酸化的影響。動(dòng)物模型觀察BDNF對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和存活時(shí)間的影響。結(jié)果：(1)BDNF以濃度依賴性方

16、式促進(jìn)RPMI8226、U266、KM3細(xì)胞和原代MM細(xì)胞的存活和增殖。(2)BDNF可促進(jìn)MM細(xì)胞的遷移和侵襲，BDNF對(duì)RPMI8226及KM3細(xì)胞具有明顯的遷移促進(jìn)作用，12.5ng/ml～200ng/mlBDNF作用后遷移指數(shù)分別為1.63～3.11和1.92～3.76，其最大遷移活性分別在50ng/ml(P＜0.05)和25ng/ml(P＜0.01)時(shí)達(dá)到；而BDNF對(duì)U266的遷移僅有中等強(qiáng)度的促進(jìn)作用，遷移指數(shù)為1.2～2

17、.1。(3)BDNF可明顯降低馬法蘭和長(zhǎng)春新堿的細(xì)胞毒性，50ng/mlBDNF作用后，馬法蘭和長(zhǎng)春新堿的EC50分別為無BDNF作用時(shí)的2倍和3倍。(4)BDNF可明顯促進(jìn)異種移植的MM裸鼠模型中腫瘤的生長(zhǎng)，增加腫塊的體積和重量，縮短裸鼠的生存時(shí)間。(5)MM細(xì)胞中異常表達(dá)的TrkB受體是BDNF的功能性受體，外源性BDNF作用后，MM細(xì)胞TrkB磷酸化水平明顯增加，并且Trk抑制劑K252a可明顯抑制BDNF誘導(dǎo)的MM細(xì)胞遷移。