P450-EETs途徑在多發(fā)性骨髓瘤疾病進(jìn)展中的作用.pdf

1、第一部分EETs在多發(fā)性骨髓瘤中表達(dá)的研究
　　目的：研究多發(fā)性骨髓瘤細(xì)（MM）胞系和臨床標(biāo)本中環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs）的表達(dá)情況。
　　 方法：培養(yǎng)U266和RPMI8226細(xì)胞，Elisa 法檢測(cè)細(xì)胞中11,12-EET和14,15-EET的水平。收集多發(fā)性骨髓瘤患者外周血標(biāo)本和臨床相關(guān)指標(biāo)，離心分離血清，Elisa 法檢測(cè)血清中11,12-EET和14,15-EET以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的水平，統(tǒng)計(jì)學(xué)

2、分析EETs的水平與MM 臨床相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。RT-PCR法檢測(cè)P450表氧化酶亞家族成員CYP2J2的mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：骨髓瘤細(xì)胞U266和RPMI8226中均存在11,12-EET和14,15-EET的表達(dá)。2×106/ml的U266細(xì)胞中11,12-EET的水平為239789.80±50297.81pg/ml，14,15-EET的水平為642293.81±28930.74pg/ml；相同數(shù)目的RPMI822

3、6細(xì)胞中11,12-EET為188487.56±58858.03pg/ml，14,15-EET為536489.31±21331.71 pg/ml的。骨髓瘤患者的血清中也存在11,12-EET和14,15-EET的表達(dá)，且水平顯著高于健康對(duì)照者。但EETs的水平與多發(fā)性骨髓瘤不良預(yù)后因子如LDH和β2-微球蛋白以及VEGF之間的無(wú)相關(guān)性。P450表氧化酶亞家族成員CYP2J2在骨髓瘤細(xì)胞U266中表達(dá)，但在RPMI8226細(xì)胞中未檢測(cè)到C

4、YP2J2的mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論：多發(fā)性骨髓瘤中存在11,12-EET和14,15-EET的表達(dá)。骨髓瘤患者血清中EETs的水平顯著高于健康對(duì)照者，提示EETs 可能是多發(fā)性骨髓瘤的病理特征之一。
　　 第二部分P450-EETs 途徑在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡中的作用及機(jī)制研究
　　 目的：研究P450-EETs 途徑在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡中的影響，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 方法：El

5、isa 法檢測(cè)經(jīng)17-ODYA 作用后U266和RPMI8226細(xì)胞中11,12-EET和14,15-EET 水平的變化。MTT 法檢測(cè)11,12-EET，14,15-EET和17-ODYA 對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)17-ODYA 對(duì)U266和RPMI8226細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響。凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Bax,Bcl-2,cyclinD1的表達(dá)由western blotting 法檢測(cè)。
　　 結(jié)果：17-O

6、DYA的作用降低U266和RPMI8226細(xì)胞中11,12-EET和14,15-EET的水平,抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖。100μmol/L的17-ODYA 作用于U266細(xì)胞48 小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)11,12-EET的水平下降至126844.34±21873.65pg/ml，14,15-EET的水平下降至386152.86±62308.52pg/ml，對(duì)U266細(xì)胞的增殖抑制率為50.85±3.64％，與對(duì)照組相比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。外源性EE

7、Ts的作用可促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的增殖，并可逆轉(zhuǎn)17-ODYA 介導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞增殖的下降。400nmol/L的11,12-EET 作用于U266和RPMI8226細(xì)胞達(dá)48h后，MM細(xì)胞的增殖率分別為58.05±3.64％和89.7±3.64％，與溶劑組相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。17-ODYA 可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)的下降，Bax的升高，周期蛋白CyclinD1表達(dá)的下降，從而使得骨髓瘤細(xì)胞的凋亡增加和細(xì)胞在G0/G1 期的阻滯。10

8、0μmol/L的17-ODYA 作用于U266細(xì)胞48 小時(shí)后，凋亡率為8.6±0.3％，對(duì)照組為2.5±1.25％；100μmol/L的17-ODYA 作用于RPMI8226細(xì)胞48 小時(shí)后，G0/G1 期細(xì)胞比例由31.72±0.55％上升至39.38±0.8％。
　　 結(jié)論：P450-EETs 途徑可影響多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡，17-ODYA 可抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖，并可能成為骨髓瘤治療的新手段。
　　 第三部

9、分P450-EETs 途徑在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞促血管新生中的作用研究
　　 目的：研究環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs）在多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞培養(yǎng)上清中的表達(dá)及其在多發(fā)性骨髓瘤誘導(dǎo)的血管新生中的作用。
　　 方法：培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系U266和RPMI8226細(xì)胞，制備其培養(yǎng)上清液，Elisa法檢測(cè)其培養(yǎng)上清中11,12-EET和14,15-EET的水平。培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），MM細(xì)胞培養(yǎng)上清液作用于HUVE

10、C，應(yīng)用MTT 法，transwell 遷移實(shí)驗(yàn)，小管形成實(shí)驗(yàn)和matrigel plug 實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)兩種MM細(xì)胞系誘導(dǎo)HUVEC 增殖，遷移，小管形成和體內(nèi)血管形成的能力。17-ODYA 作用于U266和RPMI8226，MTT 法和小管形成實(shí)驗(yàn)觀察17-ODYA 對(duì)MM細(xì)胞誘導(dǎo)的HUVEC 增殖和小管形成的作用，Elisa 法觀察對(duì)MM細(xì)胞培養(yǎng)上清中11,12-EET和14,15-EET的影響。
　　 結(jié)果：U266和RPM

11、I8226 可分泌11,12-EET和14,15-EET 至培養(yǎng)上清中，且U266細(xì)胞培養(yǎng)上清中兩種EETs的水平均明顯高于RPMI8226。U266的培養(yǎng)上清可誘導(dǎo)HUVEC的增殖，遷移，小管形成和matrigel plug中的血管新生，與RPMI8226組相比較，均明顯高于RPMI8226組，這種促血管新生的能力與兩種MM細(xì)胞系培養(yǎng)上清中EETs的水平呈正相關(guān)。17-ODYA，是一種P450表氧化酶的抑制劑，作用于U266和RPMI

12、8226后，可抑制MM細(xì)胞誘導(dǎo)HUVEC的增殖和小管形成，與對(duì)照組相比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，17-ODYA 可降低U266和RPMI8226 培養(yǎng)上清中11,12-EET和14,15-EET的水平。
　　 結(jié)論：來(lái)源于MM細(xì)胞的EETs在多發(fā)性骨髓瘤的血管新生中起到重要作用，其抑制劑17-ODYA 可抑制此效應(yīng)。
　　 第四部分P450-EETs 途徑在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞移動(dòng)性中的作用及機(jī)制研究
　　 目的：本

13、實(shí)驗(yàn)觀察17-ODYA 對(duì)多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞遷移和侵襲的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 方法：Transwell模型檢測(cè)17-ODYA 對(duì)U266和RPMI8226 遷移和侵襲的影響，明膠酶譜法檢測(cè)17-ODYA 對(duì)U266和RPMI8226 培養(yǎng)上清中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2和-9的影響，western blotting 法檢測(cè)17-ODYA 對(duì)MM細(xì)胞中MMP-2，MMP-9，p-Akt，Akt和HIF-1α

14、的影響。
　　 結(jié)果：17-ODYA 可抑制U266和RPMI8226的遷移和侵襲，與對(duì)照組相比較，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且這種效應(yīng)呈時(shí)間依賴性。100μmol/L的17-ODYA 作用24小時(shí)后，U266和RPMI8226 培養(yǎng)上清中MMP-2和MMP-9的活性下降，且在其在U266和RPMI8226細(xì)胞中的蛋白水平也同時(shí)下降。17-ODYA的作用下調(diào)了Akt的磷酸化水平，但對(duì)Akt和HIF-1α的蛋白水平卻無(wú)影響。