基于TAT的聚合物疫苗遞送系統(tǒng)的構(gòu)建及消化道免疫效果的評價.pdf

1、口服疫苗通過胃腸粘膜進行抗原遞送，經(jīng)消化道內(nèi)的免疫應(yīng)答通路產(chǎn)生與常規(guī)注射類似的免疫反應(yīng)。但由于具有免疫原性的物質(zhì)如蛋白，核酸類藥物不穩(wěn)定，進入消化道后易受消化道內(nèi)惡劣的酶和pH環(huán)境的影響導(dǎo)致大量被降解；其次，這些大分子藥物難以突破消化道上皮細胞屏障進入粘膜下層與免疫應(yīng)答通路產(chǎn)生相互作用，因而胃腸粘膜對抗原產(chǎn)生免疫的能力弱，口服免疫所需的抗原量很大，使口服免疫的應(yīng)用受到了限制。隨著醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)采用聚合物納米載體可有

2、效保護大分子藥物不被降解，延長在消化道內(nèi)粘膜的滯留時間，同時克服胃腸道上皮細胞屏障，提高抗原與免疫通路的相互作用，有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答而備受關(guān)注。
　　本課題以具有免疫原性的大分子——卵清蛋白（OVA）為模型藥物，設(shè)計構(gòu)建了一種基于穿膜肽TAT的聚合物藥物載體，即TAT修飾的聚丙交酯乙交酯-γ-聚谷氨酸納米粒（TAT PLGA-γ-PGA NPs）。該疫苗遞送系統(tǒng)利用TAT的高效穿膜作用克服消化道粘膜上皮細胞屏障，誘導(dǎo)機體產(chǎn)

3、生免疫反應(yīng)，為口服疫苗遞送系統(tǒng)的設(shè)計提供有價值的參考。
　　本研究第一章對聚合物納米粒進行制備和表征。首先將聚丙交酯乙交酯（PLGA-COOH）與γ-聚谷氨酸（γ-PGA）通過伸乙二氧基二乙胺基（EbE）共價連接合成聚丙交酯乙交酯-γ-聚谷氨酸（PLGA-γ-PGA）共聚物。經(jīng)1H核磁圖譜表征，共聚物PLGA-γ-PGA已成功合成了。再將共聚物PLGA-γ-PGA與穿膜肽TAT共價連接形成TAT修飾的PLGA-γ-PGA。采用W/

4、O/W復(fù)乳化-溶劑揮發(fā)法制備包載OVA的PLGA-γ-PGA NPs與TAT PLGA-γ-PGA NPs，粒徑分別為（282.5±11.6） nm，(263.8±7.4)nm，粒徑分布較為均一； Zeta電位分別為（-27.9±2.6）mV，（20.0±1.8）mV；載藥量分別為(6.43±0.26)％，(4.54±0.83)%；包封率分別為(68.7±3.0)%，(47.7±9.1)%。掃描電鏡下觀察到兩種聚合物納米載體形態(tài)均為球形

5、，分布均一，具有空洞結(jié)構(gòu)。體外藥物釋放結(jié)果顯示，聚合物納米粒明顯減緩了OVA釋放速度，并且TAT PLGA-γ-PGA NPs的釋藥行為比PLGA-γ-PGA NPs更為緩慢。
　　本研究第二章以Caco-2細胞為細胞模型，通過香豆素6（C6）熒光探針對聚合物納米粒的細胞攝取及轉(zhuǎn)運機制進行了研究。細胞攝取結(jié)果顯示，TAT PLGA-γ-PGA NPs在胞內(nèi)的熒光強度明顯高于PLGA-γ-PGA NPs，且隨著TAT
　　修飾

6、量的增加而增加。表明TAT能夠顯著提高PLGA-γ-PGA NPs細胞攝取能力。采用不同攝取抑制劑對聚合物納米粒的攝取機制進行研究，結(jié)果表明 TAT PLGA-γ-PGA NPs借助穿膜肽TAT與細胞表面硫酸乙酰肝素受體相互作用，并通過網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞攝取入胞，而不經(jīng)過大胞飲。聚合物納米載體胞內(nèi)轉(zhuǎn)運途徑研究結(jié)果顯示，TAT PLGA-γ-PGA NP攝取進入細胞后，胞內(nèi)轉(zhuǎn)運經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，而不經(jīng)過溶酶體。以培養(yǎng)2

7、1天后的Caco-2細胞單層膜為模型，考察聚合物納米粒跨膜轉(zhuǎn)運能力?？缒まD(zhuǎn)運2h后，在共聚焦顯微鏡下對Z軸進行3D掃描，兩種聚合物納米載體均分布于Caco-2細胞層BL側(cè)，且TAT PLGA-γ-PGA NPs轉(zhuǎn)運量明顯多于PLGA-γ-PGA NPs。同時有大量TAT PLGA-γ-PGA NPs跨過了Caco-2單層細胞膜蓄積在transwell聚碳酸脂膜孔道里，而PLGA-γ-PGA NPs只有少量跨過。表明TAT PLGA-γ-

8、PGA NPs的跨上皮細胞屏障的能力要強于PLGA-γ-PGA NPs。
　　本研究第三章以雌性Balb/c小鼠為動物模型，評價了各聚合物納米粒克服小腸上皮細胞屏障的能力。以DiO和DiI共標(biāo)記的聚合物納米載體給小鼠灌胃后，2小時取出十二指腸、空腸和回腸進行切片，在共聚焦顯微鏡下觀察兩種聚合物納米載體在各腸段中的吸收分布情況。結(jié)果顯示，PLGA-γ-PGA NPs主要分布在腸腔中，小腸絨毛攝取很少；而TAT PLGA-γ-PGA

9、NPs大量吸附于小腸絨毛表面，同時大量被攝取進入小腸絨毛內(nèi)，分布于黏膜固有層。TAT PLGA-γ-PGA NP在小腸絨毛中攝取的量是PLGA-γ-PGA NP的5-6倍。同時我們發(fā)現(xiàn)兩種納米載體均被小腸淋巴派氏結(jié)攝取，TAT PLGA-γ-PGA NPs在派氏結(jié)中的量是PLGA-γ-PGA NPs的2.2倍。結(jié)果表明TAT PLGA-γ-PGA NPs能夠高效地跨過了小腸上皮細胞屏障，進入了小腸粘膜固有層和派氏結(jié)淋巴系統(tǒng)，增加聚合物納

10、米粒與消化道免疫系統(tǒng)的相互作用。
　　本研究第四章以雌性 Balb/c小鼠為動物模型，對載有免疫原性卵清蛋白（OVA）的聚合物納米載體在消化道內(nèi)的免疫反應(yīng)進行了評價。測定了消化道黏膜免疫所產(chǎn)生的OVA特異性的分泌性IgA（OVA-sIgA）和血液中的OVA特異性抗體IgG（OVA-sIgG）水平。結(jié)果顯示聚合物納米?？梢酝ㄟ^口服的形式，有效地遞送疫苗，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生全身免疫反應(yīng)和粘膜免疫反應(yīng)。OAV TAT PLGA-γ-PGA N

11、Ps免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的OVA-sIgG和OVA-sIgA量明顯高于其他口服組。表明我們設(shè)計構(gòu)建的TAT PLGA-γ-PGA NPs有效地增加了口服疫苗的遞送，提高了小鼠全身和黏膜免疫應(yīng)答能力，為口服疫苗載體的設(shè)計提供了有價值的參考。
　　綜上所述，OVA TAT PLGA-γ-PGA NPs借助于TAT的穿膜作用，能夠高效地跨過小腸上皮細胞屏障，提高了聚合物納米粒與粘膜固有層和淋巴系統(tǒng)中免疫細胞的相互作用，顯著提高了OVA全身和黏膜