綠色組織特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗蟲融合基因表達(dá)方法可以最小化Bt蛋白在水稻種子中的表達(dá).pdf

1、許多轉(zhuǎn)抗蟲基因作物表達(dá)Bt殺蟲蛋白已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于提高作物性狀，例如玉米和棉花。然而對(duì)于轉(zhuǎn)Bt基因水稻商業(yè)化種植生產(chǎn)，人們一直爭(zhēng)論Bt蛋白在水稻種子中表達(dá)是否安全這個(gè)問題。同時(shí)隨著越來越多的轉(zhuǎn)Bt基因植物種植，并且多為轉(zhuǎn)單一Bt毒素蛋白基因，昆蟲抗性問題日益突出。針對(duì)以上問題，本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究采用綠色組織特異表達(dá)和融合抗蟲基因方法。構(gòu)建兩個(gè)轉(zhuǎn)化載體pGreen-Cry1Ac-223和pZmUbi-Cry1Ac-223，將cry1Ac基因和2

2、23基因融合在一起形成cry1Ac-223蟲基因，分別采用pGreen綠色組織特異啟動(dòng)子和ZmUbi啟動(dòng)子來指導(dǎo)融合抗蟲基因表達(dá)，以抗草甘膦基因G10作為篩選標(biāo)記，對(duì)比研究pGreen啟動(dòng)子的特異性和促進(jìn)基因表達(dá)能力。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法獲得抗蟲抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因水稻株系。在溫室中，利用棉鈴蟲對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行抗蟲生物測(cè)定，獲得轉(zhuǎn)融合抗蟲基因水稻陽性株系。對(duì)陽性株系草甘膦活性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻有很好的抗性。利用western blot分

3、析來比較pGreen啟動(dòng)子和ZmUbi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)融合基因表達(dá)能力，證實(shí)攜帶pGreen啟動(dòng)子水稻株系融合基因只在綠色組織中特異表達(dá)，而在種子中幾乎檢測(cè)不到，低于17ng/g。對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行田間評(píng)估和southern blot分析，鑒定得到單拷貝，結(jié)合農(nóng)藝性狀分析選取優(yōu)秀株系S20，借助Tail-PCR和普通PCR方法確定T-DNA插入位點(diǎn)。在田間實(shí)驗(yàn)條件下，利用水稻二化螟和稻縱卷葉螟進(jìn)行抗蟲生物測(cè)定，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因水稻株系S20具有很