不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下馬鈴薯蛋白酶抑制劑PinⅡ轉(zhuǎn)基因水稻的遺傳、表達(dá)和抗蟲性分析.pdf

1、蛋白酶抑制劑是一類廣泛存在于植物中的蛋白質(zhì)。它不僅是植物的儲(chǔ)藏蛋白，而且是植物中重要的防御蛋白。馬鈴薯蛋白酶抑制劑PinⅡ?qū)儆诮z氨酸蛋白酶抑制劑家族，可以同時(shí)抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性，因而對(duì)害蟲產(chǎn)生廣譜和穩(wěn)定抗性。本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法得到了PinⅡ日本晴轉(zhuǎn)基因水稻，并以不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下馬鈴薯蛋白酶抑制劑PinⅡ三個(gè)品種的轉(zhuǎn)基因水稻為材料，進(jìn)行了遺傳、表達(dá)和抗蟲性分析，主要研究結(jié)果如下： 1、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)

2、建的雙元載體pNAR301(ActI5’+PinⅡ+2x+PinⅡ3’)， pNAR302(Ubi5’+PinⅡ-2x-NOS3’)和pNAR303(PinⅡ5’+PinⅡ-4x+PinⅡ3’)導(dǎo)入水稻品種日本晴中，共得到12株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因苗，經(jīng)離體葉片潮霉素抗性篩選和PCR鑒定，共有8株呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為67.7％。 2、經(jīng)潮霉素抗性篩選、PCR和Southern blot等檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻后代進(jìn)行了遺傳分析。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶

3、基因hpt在68.4％的轉(zhuǎn)基因植株中符合孟德爾遺傳模式；具有潮霉素抗性的植株在PcR中均能擴(kuò)增出目的條帶；Southern blot檢測(cè)顯示：外源基因大部分以單拷貝插入植物基因組，單拷貝植株率為63.6％，且沒有出現(xiàn)基因重排現(xiàn)象。由此證明，馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅱ基因已經(jīng)穩(wěn)定整合入水稻基因組。 3、利用Northern blot分析和酶活性測(cè)定的方式，分別在RNA水平和蛋白水平檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)。PinⅡ在不同植株中的

4、轉(zhuǎn)錄不同，且與其在轉(zhuǎn)基因植株基因組中的拷貝數(shù)無(wú)關(guān)；蛋白酶抑制劑對(duì)胰蛋白酶活性的抑制程度與基因的啟動(dòng)子強(qiáng)度有關(guān)，ActI和Ubi驅(qū)動(dòng)的PinⅡ-2x轉(zhuǎn)基因水稻植株中，每克鮮葉片的PinⅡ蛋白含量為16μg和17μg，而由PIN5’驅(qū)動(dòng)的PinⅡ-4x敘為104μg，對(duì)照水稻僅為20μg。ActI和Ubi驅(qū)動(dòng)的PinⅡ表達(dá)產(chǎn)物對(duì)胰蛋白酶活性抑制程度分別達(dá)到37.7％和43.1％，明顯高于PinⅡ自身啟動(dòng)子PinⅡ5’(29.2％)。

5、 4、分別選擇粘蟲、二化螟、稻縱卷葉螟和褐飛虱，對(duì)PinⅡT<,3>代轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行抗蟲性分析。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因植株不能使初孵粘蟲致死，而且對(duì)其幼蟲生長(zhǎng)的抑制程度不高，對(duì)粘蟲的生育期影響不顯著，啟動(dòng)子效率、PinⅡ表達(dá)量與抗粘蟲性之間也沒有相關(guān)性；轉(zhuǎn)基因植株對(duì)二化螟生長(zhǎng)具有明顯的抑制效應(yīng)，幼蟲體重、體長(zhǎng)、齡期均顯著低于對(duì)照植株；僅部分轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì)稻縱卷葉螟的生長(zhǎng)有抑制作用；轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株在褐飛虱掘性級(jí)別相似，對(duì)褐飛虱無(wú)抗