不同啟動子驅動下馬鈴薯蛋白酶抑制劑PinⅡ轉基因水稻的遺傳、表達和抗蟲性分析.pdf

1、蛋白酶抑制劑是一類廣泛存在于植物中的蛋白質。它不僅是植物的儲藏蛋白，而且是植物中重要的防御蛋白。馬鈴薯蛋白酶抑制劑PinⅡ屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，可以同時抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性，因而對害蟲產生廣譜和穩(wěn)定抗性。本研究通過農桿菌介導法得到了PinⅡ日本晴轉基因水稻，并以不同啟動子驅動下馬鈴薯蛋白酶抑制劑PinⅡ三個品種的轉基因水稻為材料，進行了遺傳、表達和抗蟲性分析，主要研究結果如下： 1、利用農桿菌介導法，將本實驗室構

2、建的雙元載體pNAR301(ActI5’+PinⅡ+2x+PinⅡ3’)， pNAR302(Ubi5’+PinⅡ-2x-NOS3’)和pNAR303(PinⅡ5’+PinⅡ-4x+PinⅡ3’)導入水稻品種日本晴中，共得到12株獨立的轉基因苗，經離體葉片潮霉素抗性篩選和PCR鑒定，共有8株呈陽性，陽性率為67.7％。 2、經潮霉素抗性篩選、PCR和Southern blot等檢測對轉基因水稻后代進行了遺傳分析。潮霉素磷酸轉移酶

3、基因hpt在68.4％的轉基因植株中符合孟德爾遺傳模式；具有潮霉素抗性的植株在PcR中均能擴增出目的條帶；Southern blot檢測顯示：外源基因大部分以單拷貝插入植物基因組，單拷貝植株率為63.6％，且沒有出現基因重排現象。由此證明，馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅱ基因已經穩(wěn)定整合入水稻基因組。 3、利用Northern blot分析和酶活性測定的方式，分別在RNA水平和蛋白水平檢測目的基因在轉基因植株中的表達。PinⅡ在不同植株中的

4、轉錄不同，且與其在轉基因植株基因組中的拷貝數無關；蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶活性的抑制程度與基因的啟動子強度有關，ActI和Ubi驅動的PinⅡ-2x轉基因水稻植株中，每克鮮葉片的PinⅡ蛋白含量為16μg和17μg，而由PIN5’驅動的PinⅡ-4x敘為104μg，對照水稻僅為20μg。ActI和Ubi驅動的PinⅡ表達產物對胰蛋白酶活性抑制程度分別達到37.7％和43.1％，明顯高于PinⅡ自身啟動子PinⅡ5’(29.2％)。

5、 4、分別選擇粘蟲、二化螟、稻縱卷葉螟和褐飛虱，對PinⅡT<,3>代轉基因水稻植株進行抗蟲性分析。結果顯示：轉基因植株不能使初孵粘蟲致死，而且對其幼蟲生長的抑制程度不高，對粘蟲的生育期影響不顯著，啟動子效率、PinⅡ表達量與抗粘蟲性之間也沒有相關性；轉基因植株對二化螟生長具有明顯的抑制效應，幼蟲體重、體長、齡期均顯著低于對照植株；僅部分轉基因植株表現出對稻縱卷葉螟的生長有抑制作用；轉基因植株和對照植株在褐飛虱掘性級別相似，對褐飛虱無抗