水稻oryzasatival.rsg6基因及其啟動子的表達(dá)研究

1、四川大學(xué)博士學(xué)位論文水稻（Oryza sativa L.）RSG6基因及其啟動子的表達(dá)研究姓名：蘭利瓊申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：陳放20031101四川大學(xué)博士學(xué)位論文發(fā)揮作用。以R S G 6 基因的c D N A 中的一段與p a l 2 2 1 中的C a M V 3 5 S 啟動子連接，轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體p B ／' N 1 9 中構(gòu)建反義表達(dá)載體p B I N l 9 - F a n 以及帶有報告基因的p

2、B I N l 9 一F a n ，G U S ，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌( A g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) E H A l 0 5 后，感染水稻愈傷組織，獲得了抗性愈傷組織，其得率分別是2 7 ％和2 1 ％，轉(zhuǎn)p B I N l 9 - F a n - G U S 的抗性愈傷組織經(jīng)G U S 基因片段的P C R 檢測，陽性率為4 2 8 6 ％。另一方面，將R S G 6 基因全

3、長讀碼框與表達(dá)載體p B l l 2 1 連接構(gòu)建了重組質(zhì)粒p B I l 2 1 - R S G 6 ，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得了能夠使R S G 6 基因在其它植物中表達(dá)的農(nóng)桿菌工程菌株，為進(jìn)一步探討兄S G 6 基因的功能打下了基礎(chǔ)。利用已知的麟基因序列和G e n B a n k 中提供的R S G 6 前導(dǎo)序列設(shè)計引物，通過基因組D N A 的P C R 擴(kuò)增得到兄S G 6 基因的上游片段，分析顯示其序列中含有大量的啟動子元件。通過

4、設(shè)計帶有酶切位點的引物擴(kuò)增出缺失片段P S l 、P S 2 、P B l 、P B 2 ，利用質(zhì)粒p B l 2 2 1 中的G 皤基因作為報告基因，最后與植物表達(dá)載體p l I N l 9 連接構(gòu)建出重組質(zhì)粒p B I N l 9 。G U S S l 、p a r N l 9 ．G U S S 2 、p B I N l 9 - G U S B l 、p B I N l 9 - G U S B 2 以及陽性對照p B I N l 9

5、 - G U S ，利用農(nóng)桿菌E H A l 0 5 轉(zhuǎn)化煙草( N i c o t i a n a t a b a c u mL ) 和水稻。通過在煙草葉片、成熟花粉和水稻愈傷組織中的瞬時表達(dá)，證實這四個缺失片段都具有啟動子功能。而且，這四個片段雖然不具有種屬特異性和組織特異性，但表現(xiàn)出啟動效率上的組織差異性，推測R S G 6 基因在不同組織和雄配子發(fā)育的不同階段中表達(dá)的差異性很可能就主要是源于其啟動子功能的組織差異性。在煙草的穩(wěn)定

6、轉(zhuǎn)化中，5 種重組質(zhì)粒分別以4 4 ．9 8 ％、3 6 ．9 4 ％、4 2 ．1 3 ％、3 0 ．2 6 ％積3 4 ，2 6 ％的比例獲得轉(zhuǎn)基因幼苗。為進(jìn)一步定量地研究腳6 基因上游序列的啟動子功能奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：水稻( O r y z a s a t i v a L ) ；精細(xì)胞；R S G 6 基因；R N A 原位雜交；免疫定位；啟動子；缺失片段；瞬時表達(dá)；穩(wěn)定表達(dá)：轉(zhuǎn)基因煙草；反義表達(dá)；正義表達(dá)載體；愈傷組織。I X