PDE4B在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用.pdf

1、目的:前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)PDE4B在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中高表達(dá)，而PDE4B敲除后，能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，但PDE4B在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中可能的作用機(jī)制尚不清楚。故本研究從整體和細(xì)胞兩個(gè)水平，探討其具體作用機(jī)制。
　　方法:通過(guò)LPS2mg/kg氣道滴入誘導(dǎo)的急性肺損傷模型，以PDE4B敲除小鼠和野生型C57/BL6小鼠為研究對(duì)象，研究PDE4B在急性肺損傷整體動(dòng)物模型上的作用。LPS氣道滴入后6h，右側(cè)結(jié)扎

2、取肺，左側(cè)灌洗取肺泡灌洗液(BALF)，采用EILSA測(cè)定BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β相關(guān)炎癥因子的含量;采用熒光定量PCR測(cè)定了PDE4B、TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB的mRNA表達(dá)水平;采用WB分析肺組織中的NF-κB、IKK信號(hào)通路蛋白。
　　采用電轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染PDE4B-siRNA，沉默MHS細(xì)胞表達(dá)PDE4B。熒光定量PCR方法檢測(cè)PDE4B沉默效率。采用LPS500ng/ml分別刺激6h，

3、6h后分別收獲細(xì)胞和上清。測(cè)定指標(biāo)同上。
　　采用Fugene6轉(zhuǎn)染PDE4B過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，在MH-S細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PDE4B，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)PDE4B過(guò)表達(dá)效率。轉(zhuǎn)染18h后收獲細(xì)胞和上清。測(cè)定指標(biāo)同上。
　　結(jié)果:在整體實(shí)驗(yàn)中，野生型小鼠在LPS刺激后，白細(xì)胞總數(shù)明顯增多，并以中性粒細(xì)胞為主。炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA及其蛋白大量合成和分泌。IKK蛋白大量磷酸化，NF-κB mRNA和蛋白

4、表達(dá)也相應(yīng)增多。而PDE4B敲除小鼠相對(duì)野生型小鼠對(duì)LPS刺激不敏感。與對(duì)照組相比，敲除小鼠LPS刺激后，白細(xì)胞總數(shù)，中性粒細(xì)胞增多較少;LPS刺激引起的TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥介質(zhì)的mRNA表達(dá)和蛋白分泌明顯減少;同時(shí)IKK蛋白磷酸化減少，NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)也相應(yīng)減少。
　　在體外實(shí)驗(yàn)中，正常MHS細(xì)胞在LPS刺激后，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相似，炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)和蛋白分泌明顯增多

5、。IKK蛋白大量磷酸化,NF-κBmRNA和蛋白表達(dá)相應(yīng)增多。PDE4B-siRNA沉默MH-S細(xì)胞后，LPS刺激引起的TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)和蛋白分泌明顯減少，同時(shí)IKK蛋白磷酸化減少，NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)也相應(yīng)減少。而PDE4B過(guò)表達(dá)的MH-S細(xì)胞相對(duì)正常細(xì)胞表現(xiàn)出類似LPS刺激反應(yīng)。炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表達(dá)和蛋白分泌明顯增多，同時(shí)IKK蛋白磷酸化增多，NF-κB mRN