Nogo-B在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中的保護性作用及其可能機制.pdf

1、背景：內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷（Acute lung injury, ALI）
　　 本質(zhì)上是一種由巨噬細胞啟動，中性粒細胞過度激活導(dǎo)致的自我放大和失控的持續(xù)性肺部炎癥損傷。巨噬細胞在急性肺損傷的病程中，發(fā)揮始動者及決定病情未來走向的作用。炎癥環(huán)境下，巨噬細胞的黏附、遷移、分泌等能力是實現(xiàn)其生物學(xué)功能的關(guān)鍵，然而目前對于ALI 發(fā)生、發(fā)展過程中巨噬細胞上述募集相關(guān)功能的調(diào)控機制，尚不

2、明確。Nogo-B是網(wǎng)狀蛋白家族4 （reticulon peotein family, Rtn4）中的重要成員，其參與了細胞凋亡、遷移、粘附等細胞生物學(xué)過程，從而在組織損傷后修復(fù)、神經(jīng)退行性病變等病理生理過程中發(fā)揮了重要作用。最新研究顯示，Nogo-B 參與了缺血后組織損傷修復(fù)過程，其主要通過調(diào)控巨噬細胞的粘附和遷移而實現(xiàn)。在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的ALI 發(fā)生、發(fā)展過程中，Nogo-B是否同樣對巨噬細胞的募集存在調(diào)控，并通過這一機制而參與ALI

3、的發(fā)生、發(fā)展過程，目前尚未見報道。
　　 目的：明確Nogo-B在 ALI 發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用，并初步探討Nogo-B是否通過調(diào)控巨噬細胞功能發(fā)揮其在ALI 發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。
　　 方法：：一、LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型構(gòu)建及Nogo-B表達變化
　　 （一）選擇野生型雄性C57BL/6小鼠，通過LPS （O0111:B4，15mg/kg）氣管滴注的方法復(fù)制ALI小鼠模型。
　　 （

4、二）采用HE 染色、Evans blue 示蹤、BCA蛋白濃度測定、流式細胞計數(shù)、ELISA等方法分別檢測小鼠肺組織病理、肺泡-毛細血管通透性、炎癥細胞及炎癥因子濃度的改變。
　　 （三）采用免疫組化、免疫熒光、Western blot等方法檢測肺組織及肺泡巨噬細胞(Alveolar macrophage, AM)中Nogo-B表達水平的變化。
　　 二、Nogo-B 高表達腺病毒載體的構(gòu)建及其表達驗證
　　 （

5、一）化學(xué)合成小鼠Nogo-B基因，采用EcoR Ⅰ酶將穿梭質(zhì)粒Pav-MCMV-RFP-3FLAG 酶切線性化后，通過同源重組的方法將Nogo-B 連接至穿梭質(zhì)粒載體。測序鑒定無誤后，與輔助包裝質(zhì)粒Phg lox E1,3 Cre △經(jīng)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，在HEK293細胞中同源重組并包裝成重組腺病毒（Ad-Nogo-B）。
　　 （二）將Ad-Nogo-B及陰性對照腺病毒（Ad-RFP）感染RAW264.7細胞，熒光

6、顯微鏡下觀察細胞RFP表達情況，并通過Western blot 法檢測Nogo-B-RFP-3FLAG融合蛋白表達水平。
　　 三、Nogo-B在LPS 誘導(dǎo)構(gòu)建的小鼠急性肺損傷中的保護性作用
　　 （一）選用野生型雄性C57BL/6小鼠，采用頸外靜脈注射的方法構(gòu)建Nogo-B高表達小鼠。
　　 （二）使用致死劑量（25mg/kg）的LPS 復(fù)制ALI小鼠模型，記錄造模后小鼠生存時間，以觀察上調(diào)Nogo-B對AL

7、I小鼠模型生存率的影響。
　　 （三）使用正常劑量（15mg/kg）的LPS 復(fù)制ALI小鼠模型，通過HE 染色、Evans blue 示蹤、BCA蛋白濃度測定、流式細胞計數(shù)、ELISA等方法，分別觀察上調(diào)Nogo-B表達對小鼠肺組織損傷及炎癥程度的影響。
　　 四、Nogo-B對巨噬細胞募集相關(guān)功能的影響
　　 （一）選擇體外培養(yǎng)的RAW264.7細胞株，以不同濃度的LPS與細胞分別共培養(yǎng)12 h 或24 h后

8、，采用Western blot方法檢測Nogo-B的表達水平變化。
　　 （二）采用腺病毒轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)細胞Nogo-B的表達水平后，分別采用黏附實驗、Transwell 法及ELISA 法檢測上調(diào)Nogo-B表達對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細胞黏附、遷移及炎癥因子TNF-α、IL-1β、MCP-1分泌的影響。
　　 結(jié)果：一、LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型構(gòu)建及Nogo-B表達變化
　　 （一）與PBS對

9、照組比，LPS 誘導(dǎo)12 h后，小鼠肺臟呈現(xiàn)出血、滲出、肺泡間隔增厚、肺透明栓形成等典型ALI表現(xiàn)，伴有肺微血管滲透性(0.506±0.105vs.0.257±0.054, n=5）及肺泡蛋白滲出顯著增高 （1002.65±253.878vs. 567.24±220.611ug/ml, n=5)。同時，LPS 模型組BALF中，炎癥細胞總數(shù)增加(3.72±1.321vs.2.09±0.15, n=3）、TNF-α（819.21±264.

10、125vs. 260.63±173.08 pg/ml, n=4)、IL-1β(112.82±20.403vs. 31.58±15.962 pg/ml, n=4)、MCP-1(75.09±4.548vs. 55.18±3.818 pg/ml, n=4）等炎癥因子濃度顯著升高（P 均<0.05）。
　　 （二）LPS 模型組小鼠肺組織及AM中Nogo-B表達水平較對照組顯著降低。Western blot 結(jié)果顯示LPS 模型組小鼠肺

11、組織較對照組下降約5.06倍(Nogo-B/GAPDH灰度掃描：0.91±0.154vs. 0.18±0.091, n=5， P＜0.05)。
　　 二、Nogo-B 高表達腺病毒載體的構(gòu)建及其表達驗證
　　 （一）重組質(zhì)粒Pav-MCMV-Nogo-B-RFP-3FLAG構(gòu)建成功。
　　 （二）與輔助包裝質(zhì)粒Phg lox E1,3 Cre △共轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，出現(xiàn)明顯的毒斑。病毒原液濃縮、純化后，病毒

12、滴度為1×1011pfu/ml。
　　 （三）重組病毒Ad-Nogo-B 感染RAW264.7細胞72h后，含Nogo-B-RFP-3FLAG融合蛋白在細胞胞漿高表達。
　　 三、Nogo-B在LPS 誘導(dǎo)構(gòu)建的小鼠急性肺損傷中的保護性作用
　　 （一）Nogo-B 腺病毒轉(zhuǎn)染有效上調(diào)了肺組織Nogo-B的表達水平。
　　 （二）與陰性腺病毒轉(zhuǎn)染組比，Nogo-B 腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠在LPS 誘導(dǎo)后生存時間顯

13、著延長（28.7±10.78vs. 16.9±4.85 h, n=8, P＜0.05）。
　　 （三）與陰性腺病毒轉(zhuǎn)染組比，HE 結(jié)果提示Ad-Nogo-B 轉(zhuǎn)染組肺組織損傷程度減輕，Evans blue 結(jié)果顯示肺微血管通透性（29.98±6.028vs. 54.37±8.774, n=5）降低，肺泡蛋白滲出（1032.9±64.47vs. 1859.2±359.76 ug/ml, n=5）減少。同時，BALF中巨噬細胞數(shù)目增

14、加（3.65±0.862vs. 2.36±0.618×105， n=5），伴MCP-1（121.17±16.547vs. 97.67±11.68 pg/ml, n=4）水平升高，且IL-1β（282.87±75.423vs. 505.6±165.3 pg/ml, n=4）水平降低（P 均<0.05），但TNF-α（1043.94±157.12vs.
　　 959.73±143.769 pg/ml, n=4, P＞0.05）分泌水

15、平兩組無明顯差異。
　　 四、Nogo-B對巨噬細胞募集相關(guān)功能的影響（一）LPS作用12 h及24 h后，RAW264.7細胞中Nogo-B表達隨LPS濃度增高而顯著降低。
　　 （二）Nogo-B 腺病毒轉(zhuǎn)染后，RAW264.7細胞的MCP-1表達水平在LPS作用后12 h 顯著高于陰性腺病毒轉(zhuǎn)染組(12h：36.69±20.1vs. 624.63±19.158 pg/ml, n=6;24h：785.12±18.05

16、3vs. 577.4±48.634 pg/ml, n=3; 48h：626.2±35.29vs. 459.57±26.453 pg/ml, n=3，P 均<0.05)，但兩組細胞在黏附、遷移及TNF-α、IL-1β分泌水平上無明顯差異。
　　 小結(jié)：一、采用LPS 誘導(dǎo)的方法，可成功復(fù)制ALI小鼠模型。ALI小鼠肺組織及AM中Nogo-B表達顯著降低，提示Nogo-B 極有可能參與了ALI的發(fā)生、發(fā)展過程。
　　 二、成

17、功構(gòu)建出在RAW264.7細胞中高表達Nogo-B蛋白的重組腺病毒。
　　 三、Nogo-B在LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中發(fā)揮了保護性作用，該作用可能通過上調(diào)MCP-1分泌水平，促進肺泡巨噬細胞向肺部募集而實現(xiàn)。
　　 四、RAW264.7細胞中的Nogo-B蛋白在LPS作用下表達降低，恢復(fù)其表達有利于促進細胞的MCP-1分泌。
　　 結(jié)論：Nogo-B 可能通過上調(diào)MCP-1表達水平，促進肺泡巨噬細胞募集而在