Caveolin-1在LPS誘導(dǎo)AT-1細胞和小鼠肺部急性損傷中的作用及機制研究.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distresssyndrome,ARDS)為臨床常見的危重癥,主要表現(xiàn)為急性呼吸窘迫、頑固性低氧血癥和非心源性肺水腫。ALI/ARDS可發(fā)生于任何年齡段的患者,通常由嚴重感染、創(chuàng)傷、休克等因素誘發(fā)。但迄今為止其發(fā)病機制尚未完全闡明。近年來,病理研究結(jié)果顯示,ALI/ARDS發(fā)生時受損傷最明顯的結(jié)構(gòu)是肺泡上皮,尤其是肺泡Ⅰ型

2、上皮細胞(AT-1)對損傷更敏感,而且這種損傷常常發(fā)生在ALI/ARDS的早期階段。
　　 小窩蛋白(Caveolin,Cln)是一個相對分子質(zhì)量為21-24kD的膜蛋白,高度富集于蛋白小窩膜(Caveolea,Cle),是Cle的標志性蛋白,具有多種潛在功能,在維持Cle形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn),哺乳動物中至少存在3種Cln基因家族產(chǎn)物,即Cln-1,Cln-2及Cln-3。其中Cln-1廣泛存在于肺泡Ⅰ型上皮細

3、胞膜,并有證據(jù)表明Cln-1/Cle在肺泡上皮屏障功能變化中扮演重要角色。
　　 本研究應(yīng)用pRNAi-u2.6-Cln-1慢病毒載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)肺泡Ⅰ型上皮細胞(AT-1)和c57BL6小鼠,并觀察Caveolin-1基因?qū)PS致炎AT-1細胞和小鼠的影響及作用機制,為臨床防治ALI/ARDS提供新的思路。
　　 研究內(nèi)容和方法:
　　 1.小鼠Cln-1基因的克隆及載體構(gòu)建:PCR法擴增Cl-1 cDNA全

4、長基因序列,將其克隆至慢病毒表達載體pRNAi-u2.6上并進行慢病毒包裝。
　　 2.肺泡Ⅰ型上皮細胞分離、培養(yǎng):PE標記的AT-1細胞特異性抗體RTI40標記細胞,采用抗PE的免疫磁珠陽性篩選AT-1細胞,流式細胞儀測定純度。
　　 3.慢病毒載體pRNAi-u2.6-Cln-1轉(zhuǎn)染AT-1及鑒定:慢病毒載體pRNAi-u2.6-Cln-1病毒上清轉(zhuǎn)染AT-1細胞,轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光,流式細胞儀測定

5、轉(zhuǎn)染效率,用Western-blotting法鑒定轉(zhuǎn)染AT-1細胞中目的蛋白表達情況。
　　 4.Cln-1基因?qū)PS致炎AT-1細胞的影響及作用機制:
　　 (1)LPS致炎AT-1細胞模型:AT-1細胞分為轉(zhuǎn)染目的基因的實驗組及轉(zhuǎn)染空載體的對照組,均給予LPS刺激,濃度10μg/ml,分2hr和4hr兩個時相點。
　　 (2)ELISA法測定LPS致炎細胞上清液的炎性因子TNF-α、IL-6表達水平。

6、>　　 (3)熒光定量PCR法檢測LPS致炎AT-1細胞cPLA2和p38 MAPK mRNA表達變化。
　　 (4)Western blotting法檢測LPS致炎AT-1細胞cPLA2、p38 MAPK蛋白表達變化。
　　 (5)EMSA法檢測LPS致炎AT-1細胞核蛋白NF-κB表達變化。
　　 (6)特異性阻斷cPLA2、p38 MAPK、NF-κB后,細胞上清液TNF-α、IL-6表達水平變化及相互作

7、用。
　　 5.觀察Cln-1基因?qū)PS致炎小鼠的影響及作用機制:
　　 (1)慢病毒載體pRNAi-u2.6-Cln-1轉(zhuǎn)染c57BL6小鼠及LPS致炎小鼠模型:c57BL6小鼠分為轉(zhuǎn)染目的基因的實驗組及轉(zhuǎn)染空載體的對照組,經(jīng)尾靜脈注入caveolin-1慢病毒載體,1月后給予腹腔注射LPS,2mg/kg,分2hr和4hr兩個時相點。
　　 (2)ELISA法測定LPS致炎小鼠血清的TNF-α、IL-6表達水

8、平。
　　 (3)Western blotting法檢測LPS致炎小鼠肺組織cPLA2、p38 MAPK蛋白表達變化。
　　 (4)病理形態(tài)學(xué)觀察LPS致炎小鼠肺組織HE染色切片。
　　 結(jié)果:
　　 1.PCR法成功擴增出Cln-1 cDNA全長序列,并將其克隆至慢病毒表達載體pRNAi-u2.6,病毒包裝后得pRNAi-u2.6-Cln-1慢病毒。
　　 2.獲得原代培養(yǎng)的肺泡Ⅰ型上皮細胞,純

9、度可達85％～98％,細胞總量為3-5×106。
　　 3.慢病毒載體轉(zhuǎn)染肺泡Ⅰ型上皮細胞后,在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光,細胞轉(zhuǎn)染效率＞95％。Western blotting法可檢測到相應(yīng)目的蛋白的表達,24hr后Cln-1表達開始升高,36hr的表達量比轉(zhuǎn)染前表達量顯著升高,72hr達到峰值。
　　 4.LPS干預(yù)AT-1細胞后,在2hr及4hr時相點,高表達Cln-1實驗組細胞上清液TNF-α、IL-6的表

10、達水平均顯著高于對照組,P＜0.05。實驗組AT-1細胞cPLA2和p38MAPK mRNA的表達均顯著高于對照組,P＜0.05;Western blotting結(jié)果顯示,cPLA2和p38 MAPK總蛋白及磷酸化蛋白水平也同步升高,P＜0.05。EMSA法測定核蛋白的表達結(jié)果顯示:實驗組NF-κB的表達均顯著高于對照組,P＜0.05。阻斷cPLA2/p38 MAPK及下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB均可引起炎癥因子(TNF-α、IL-6)顯著下

11、降,p＜0.05。cPLA2抑制劑可以下調(diào)磷酸化的p38 MAPK及NF-κB的表達,p＜0.05;p38 MAPK抑制劑能夠降低磷酸化的cPLA2及NF-κB的表達,p＜0.05,而NF－κB的抑制劑對磷酸化的cPLA2和p38 MAPK表達無明顯影響,p＞0.05。
　　 5.LPS干預(yù)c57BL6小鼠后,在2hr及4hr時相點,高表達Cln-1實驗組小鼠血清TNF-α、IL-6的表達均顯著高于對照組,P＜0.05。實驗組小

12、鼠肺組織cPLA2和p38MAPK蛋白表達水平均顯著高于對照組,P＜0.05。小鼠肺組織病理切片顯示實驗組小鼠肺部滲出、水腫更明顯,損傷更嚴重。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建Cln-1基因高表達的肺泡Ⅰ型上皮細胞模型。
　　 2.Caveolin-1加重LPS引起的肺泡Ⅰ型上皮細胞和小鼠肺部損傷。
　　 3.Caveolin-1上調(diào)cPLA2及其信號通路下游分子p38 MAPK、NF-κB,是LPS引