高糖處理的心肌成纖維細胞中miR-375的表達及其對膠原蛋白的影響.pdf

1、目的:觀察高糖處理的心肌成纖維細胞中miR-375的表達變化，以及抑制其表達后對膠原蛋白表達的影響。
　　 方法:(1)用酶消化法分離、純化、培養(yǎng)C57BL/6小鼠的原代心肌成纖維細胞。(2)用高糖處理第1-3代的心肌成纖維細胞，建立糖尿病細胞模型。(3)心肌成纖維細胞隨機分成4組:A組，正常對照組;B組，高糖處理組;C組，高糖處理+miR-375抑制劑陰性對照組;D組，高糖處理+miR-375抑制劑組。(4)波形蛋白(Vime

2、ntin)免疫細胞化學染色法鑒定心肌成纖維細胞純度。熒光實時定量PCR方法檢測miR-375的差異性表達，熒光實時定量PCR方法檢測miR-375抑制劑的轉(zhuǎn)染效率，免疫細胞化學染色檢測Ⅰ型膠原蛋白的表達水平，WesternBlot檢測Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白表達水平。
　　 結果:(1)用酶消化法可分離獲得狀態(tài)良好、純度高的心肌成纖維細胞，培養(yǎng)的第3代心肌成纖維細胞純度可達90％。(2)與正常對照組相比，高糖處理心肌成纖維細胞

3、6，12，24h后，其miR-375的表達有增加趨勢，且在6h增加最顯著[6h組（54.95±4.1），12h組（28.84±2.5），24h組（18.77±2.22），P＜0.05]。(3)miR-375抑制劑瞬時轉(zhuǎn)染高糖處理的心肌成纖維細胞，其轉(zhuǎn)染效率達70％。(4)抑制miR-375的表達，顯著降低高糖處理的心肌成纖維細胞內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的表達。免疫細胞化學染色檢測Ⅰ膠原蛋白表達水平:D組與C組相比，Ⅰ型膠原蛋白表達水

4、平顯著降低[（38.84％±3.34）vs（76.20％±6.96），P＜0.05]。WesternBlot檢測各組心肌成纖維細胞中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達水平:D組與B組、C組相比，Ⅰ型膠原蛋白表達水平明顯降低[（0.46±0.05）vs（0.79±0.12），（0.46±0.05）vs（0.68±0.07），P＜0.05];Ⅲ型膠原蛋白表達水平顯著降低[（0.24±0.03）vs（0.72±0.09），（0.24±0.03）vs(