IL-13對成纖維細胞膠原蛋白合成的影響及其分子調控機制.pdf

1、目的和意義: 增生性瘢痕或瘢痕疙瘩是一種皮膚纖維化過程，可限制活動，影響皮膚的美觀和功能，是皮膚組織燒傷、創(chuàng)傷修復后，由于全身和局部因素的影響，導致細胞外基質(ECM)過度分泌沉積、大量纖維組織增生、膠原降解減少、血管大量生成，包括成纖維細胞在內的組織修復細胞異常增殖分化而形成的。在纖維化的起始階段，各種始動因素促使多種細胞因子的釋放。細胞因子網絡在介導炎癥及其后的纖維化過程中所起的作用日益受到重視。有研究表明，在纖維化形成過程

2、中存在1型輔助性T細胞(Th1)和2型輔助性T細胞(Th2)細胞因子間的失衡，即Th1/Th2失衡，從而促進了成纖維細胞激活、增生，細胞外基質沉積。Th1型細胞因子包括IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-18和腫瘤壞死因子-β(TNF-β)，Th2型細胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)。Th1型和Th2型細胞因子應答在纖維化方面的相反效應(即Th1型細胞因子的抗纖維化效應和Th2

3、型細胞因子的促纖維化效應)已被近來的基因芯片技術所證實。白細胞介素13(IL-13)是一種多效能的免疫調節(jié)性細胞因子，主要由激活的輔助T淋巴細胞(Th2)產生，是許多由Ⅱ類細胞因子決定的病理過程的關鍵誘導物。它能調節(jié)炎癥、黏液產生、組織重建和纖維化，它在皮膚纖維化、肺纖維化、肝纖維化等多種纖維化疾病的發(fā)生機制中起重要作用，也是多種纖維化疾病的重要治療靶點。為研究IL-13在瘢痕形成過程中的潛在作用，本研究探討IL-13對瘢痕成纖維細胞的

4、膠原合成作用及信號轉導途徑，觀察IL-13是否促進瘢痕成纖維細胞膠原基因的轉錄和膠原蛋白的合成，這一過程是否通過IL-13結合瘢痕成纖維細胞膜上的IL-13受體，從而激活JAK/STAT信號轉導通路，將胞內信號轉導和轉錄激活因子STAT6蛋白磷酸化，后轉入核內與膠原靶基因結合，上調膠原基因的轉錄，促進膠原蛋白的合成。另外觀察酪氨酸酶抑制劑A771726和抗纖維化藥物干擾素-γ是否阻斷IL-13的促瘢痕成纖維細胞的膠原合成作用，從而為IL

5、-13纖維化機制的研究和瘢痕發(fā)生機制的研究增添新內容，同時為新方法用于臨床瘢痕治療奠定理論基礎和提供實驗依據(jù)。 研究內容和方法: 1.IL-13對成纖維細胞的膠原合成作用的影響：體外培養(yǎng)成纖維細胞，繪制細胞生長曲線觀察細胞生長狀態(tài)。細胞分為實驗組和對照組，實驗組加入IL-13(100μg/L)，對照組不加細胞因子，HE染色觀察細胞形態(tài)，膠原纖維的特殊染色觀察膠原纖維的形成，MTT法觀察不同濃度的IL-13對成纖維細胞增殖

6、作用的影響。IL-13作用24、48、72小時后，羥脯氨酸檢測IL-13對成纖維細胞分泌膠原蛋白的影響，RT-PCR觀察IL-13對成纖維細胞Ⅰ型膠原α1基因(COL1A1)mRNA水平表達的影響，Western-Blotting觀察IL-13對成纖維細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響。 2.IL-13對成纖維細胞作用的信號轉導通路的研究：RT-PCR檢測成纖維細胞IL-13受體僅α1的表達，Western-Blotting觀察IL-1

7、3作用成纖維細胞1、2、4、8小時后轉錄因子STAT6磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白的表達。 3.酪氨酸酶抑制劑A771726阻斷IL-13對成纖維細胞的促膠原蛋白合成作用：MTT法觀察不同濃度的A771726對成纖維細胞的增殖作用的影響。成纖維細胞分為實驗組和實驗對照組，實驗對照組加入IL-13(100μg/L)，實驗組加入A771726(50μM)和IL-13(100μg/L)，作用24、48、72小時后，羥脯氨酸檢測A77172

8、6對IL-13促進成纖維細胞分泌膠原蛋白的影響，RT-PCR觀察A771726對IL-13促進成纖維細胞Ⅰ型膠原α1基因mRNA水平表達的影響，Western-Blotting觀察A771726對IL-13促進成纖維細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響。 4.干擾素-γ抑制IL-13對成纖維細胞的促膠原蛋白合成作用：MTT法觀察不同濃度的干擾素-γ對成纖維細胞的增殖作用的影響。成纖維細胞分為實驗組和空白對照組，實驗組加入干擾素-γ(4×1

9、05U/L)和IL-13(100μg/L)，作用24、48、72小時后，羥脯氨酸檢測干擾素-γ是否抑制IL-13促進成纖維細胞分泌膠原蛋白，RT-PCR觀察干擾素-γ是否抑制IL-13促進成纖維細胞Ⅰ型膠原α1基因mRNA水平的表達，Western-Blotting觀察干擾素-γ是否抑制IL-13促進成纖維細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白。 結果: 1.IL-13促進成纖維細胞的膠原合成作用：HE染色觀察到實驗組細胞增長旺盛，有明顯

10、的交叉重疊現(xiàn)象，胞漿豐富，但大體形態(tài)與對照組細胞無明顯差別；膠原纖維特殊染色觀察到實驗組膠原纖維合成增加；MTT法觀察到IL-13促進瘢痕成纖維細胞增殖；羥脯氨酸檢測實驗組細胞培養(yǎng)上清液分泌總膠原蛋白含量在IL-13作用48h、72h后顯著高于對照組；RT-PCR檢測到成纖維細胞表達Ⅰ型膠原α1基因，且IL-13作用48h、72h后，表達顯著增強；Western Blotting檢測到成纖維細胞表達I型膠原蛋白，且IL-13作用48h、

11、72h后，表達顯著增強。 2.IL-13介導成纖維細胞STAT6磷酸化：RT-PCR檢測到成纖維細胞表達IL-13受體α1，Western-Blotting觀察IL-13作用成纖維細胞1、2、4、8小時后均有非磷酸化STAT6蛋白的表達，IL-13作用2h后磷酸化STAT6蛋白表達最強，4h后衰減。 3.酪氨酸酶抑制劑A771726阻斷IL-13對成纖維細胞的促膠原蛋白合成作用：MTT法觀察到A771726可抑制成纖維細

12、胞的增殖，羥脯氨酸檢測實驗組48h組和72h組成纖維細胞分泌膠原蛋白的含量顯著低于實驗對照組，RT-PCR觀察到實驗組48h組和72h組成纖維細胞Ⅰ型膠原α1基因mRNA表達水平顯著低于實驗對照組，Western-Blotting觀察到實驗組48h組和72h組成纖維細胞分泌I型膠原蛋白的水平顯著低于空白對照組。 4.干擾素-γ抑制IL-13對成纖維細胞的促膠原蛋白合成作用：MTT法觀察到干擾素-γ可抑制成纖維細胞的增殖，羥脯氨酸

13、檢測實驗組48h組和72h組成纖維細胞分泌膠原蛋白的含量顯著低于空白對照組，RT-PCR觀察到實驗組48h組和72h組成纖維細胞Ⅰ型膠原α1基因mRNA表達水平顯著低于空白對照組，Western-Blotting觀察到實驗組48h組和72h組成纖維細胞分泌I型膠原蛋白的水平顯著低于空白對照組。 結論: IL-13促進成纖維細胞的增殖，IL-13促進成纖維細胞分泌膠原，IL-13促進成纖維細胞Ⅰ型膠原α1基因mRNA水平和