引起葡萄皺木復合癥的兩種線形病毒的分子特性研究.pdf

1、葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)和葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)在葡萄上引起莖溝病和栓皮病,這兩種病害均為葡萄皺木復合癥之一,對葡萄產業(yè)造成嚴重威脅。GVA和GVB在國內早有報道,但我國對其開展研究較晚,尚處于起步階段。本研究從病毒檢測入手,對來源于我國鄭州國家葡萄種質資源圃、湖北省果樹茶桑研究所、中科院果樹研究所的74份葡萄樣品進行了病毒檢測；對得到的GVA中國分離物進行了組群鑒別,并

2、基于GVA外殼蛋白(Coat protein,CP)基因,利用單鏈構象多態(tài)性(Single-strand conformation polymorphisms,SSCP)技術對我國GVA分離物分子變異及群體結構進行了研究；并對我國GVB分離物分子特性進行了初步研究,取得的研究成果如下:
　　 1采用三夾心抗體ELISA(1Yiple antibody sandwich ELISA,TAS-ELISA)和反轉錄-多聚酶鏈式反應(R

3、everse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)對來自于我國3個不同地區(qū)的共74份葡萄樣品分別進行了GVA和GVB檢測。結果表明GVA檢出率高于國內之前的報道。尤其是2008年采自鄭州的樣品,GVA檢出率高達82.8％,大大高于2002年同地區(qū)采集樣品4.5％的檢出率,由此推測造成GVA昆蟲介體傳播是造成GVA大范圍發(fā)生的主要因為。相比于GVA的高檢出率,GVB則較低,最高的為

4、遼寧樣品檢出率為25％。
　　 2利用組群鑒別引物對所獲得的40個GVA分離物所屬的組群進行了鑒定,表明所有的分離物均屬于組群Ⅰ和組群Ⅱ,沒有屬于組群Ⅲ的分離物。共克隆了14個GVA中國分離物的CP基因,全長597 nt。并基于CP基因的克隆進行了SSCP分析。根據有無優(yōu)勢單體型將SSCP圖譜分為兩種類型。對各分離物中代表不同單體型的克隆進行測序,共得到114條GVA CP基因序列。遺傳距離分析表明,其中7個分離物含有高度變異的

5、分子變種,為混合侵染,證明我國GVA群體存在遺傳異質性；系統(tǒng)進化樹分析表明GVA分離物可聚為三個分枝,分別代表了三個組群,其中組群Ⅰ可聚為兩個亞組群Ⅰ A和Ⅰ B。本研究所獲得的所有GVA分子變種均屬于組群Ⅰ,且大部分分子變種屬于亞組群Ⅰ A。由此推測在這三個地區(qū),屬于GVA亞組群Ⅰ A的變種為優(yōu)勢分子變種。
　　 3得到一個分子變種組成特殊的分離物AF?；旌锨秩镜?個分離物中有4個分離物包含的分子變種分別屬于兩個亞組群。除分離

6、物AF外,其余3個分離物中屬于亞組群Ⅰ A分子變種占絕對優(yōu)勢。而分離物AF中屬于亞組群Ⅰ B的分子變種頻率稍高于亞組群Ⅰ A的分子變種。
　　 4克隆了分離物羅查里奧和奇妙無核GVB基因組3'末端,包括完整的ORF5(Open reading frame)372-375 nt和3’末端非翻譯區(qū)(3'Un-translated region,3'UTR)154-151 nt序列。ORF5和3UTR核苷酸序列系統(tǒng)進化樹表明,這兩個分

7、離物親緣關系較近,而與國外報道的分離物親緣關系較遠。
　　 5克隆得到三個GVB分離物羅查里奧、藤稔和無核白雞心的全長CP基因,大小為594 nt。序列分析表明,藤稔和無核白雞心分離物核苷酸與推導的氨基酸序列同源性均為98.5％,推測可能是由介體傳播造成病毒傳播。核苷酸系統(tǒng)進化樹分析表明,藤稔和無核白雞心分離物親緣關系很近,而羅查里奧分離物與四川SL10分離物及日本分離物親緣關系較近。氨基酸序列多重匹配分析發(fā)現,藤稔和無核白雞心