兩種葡萄卷葉伴隨病毒的基因克隆、原核表達(dá)及葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步建立.pdf

1、葡萄卷葉伴隨病毒(GLRaV)-2和GLRdaV-3是引起葡萄卷葉病(GLD)發(fā)生的兩種比較重要的病毒。目前GLD的防治措施主要是使用無病毒苗木和選育抗病品種，病毒的檢測(cè)是具體實(shí)施過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其中，血清學(xué)方法具有靈敏、快速、適合大量樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于葡萄病毒檢測(cè)中。然而，GLRaVs為韌皮部限制性病毒，在寄主植物中含量低，除GLRaV-2外均沒有煙草寄主；另外，GLRaVs的復(fù)合侵染現(xiàn)象比較普遍，因此，利用提純病毒粒

2、子的方法制備特異性的抗體比較困難，而用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組病毒蛋白制備抗體則克服了這個(gè)問題。借助于基因工程手段，利用病原獲得抗病性(PDR)進(jìn)行抗病毒育種方法克服了傳統(tǒng)育種方法中育種周期過長(zhǎng)的局限性而成為一種有效的育種手段，其中，由病毒復(fù)制酶(RdRp)基因介導(dǎo)的抗性在某些方面明顯優(yōu)于外殼蛋白(Coat protein，CP)基因介導(dǎo)的抗性已被成功應(yīng)用到多個(gè)病毒的抗病性研究上，而有關(guān)由GLRaVs RdRp基因介導(dǎo)的抗性研究目前尚無報(bào)

3、道。另外，葡萄遺傳轉(zhuǎn)化較困難，迄今為止僅在少數(shù)幾個(gè)基因型中獲得了轉(zhuǎn)基因植株，因此，建立一個(gè)高效的葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系，是保證葡萄抗病毒育種順利進(jìn)行的上游工作。 本研究旨在克隆GLRaV-2 RdRp和GLRaV-3 RdRp和CP基因后進(jìn)行原核表達(dá)獲得大量的重組蛋白制備抗血清，為國(guó)內(nèi)葡萄無病毒種苗培育和種苗調(diào)運(yùn)的檢驗(yàn)提供有效的檢測(cè)手段：另外，構(gòu)建GLRaV-2 RdRp基因的植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化煙草研究，以揭示GL

4、RaV-2 RdRp基因介導(dǎo)的抗病機(jī)制，并為進(jìn)一步的利用此策略進(jìn)行葡萄抗病毒育種提供理論依據(jù)和技術(shù)策略；最后，分別以“紅地球”、“黑奧林”“美魯特”試管苗的葉片、葉柄和莖段為試材，通過培養(yǎng)基的篩選，建立葡萄有效再生培養(yǎng)體系，以及構(gòu)建GLRaV-_3野生型。RdRp基因植物表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化煙草驗(yàn)證轉(zhuǎn)入的基因的功能后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，對(duì)以上三個(gè)品種進(jìn)行初步轉(zhuǎn)化，為培育葡萄抗病毒品種建立一個(gè)良好的技術(shù)平臺(tái)。本研究主要結(jié)果如下：

5、 1.從“二號(hào)大宛紅”樣品中克隆了GLRdV-3(GLRaV-3-EDH)的RdR_p和CP基因。序列測(cè)定結(jié)果表明，GLRaV-3-EDH RdRp基因全長(zhǎng)為1618 bp，推導(dǎo)其編碼538個(gè)aa，CP基因全長(zhǎng)942 bp，推導(dǎo)其編碼313個(gè)aa；GenBank Blast(nr)檢索結(jié)果表明，該RdRp基因與已報(bào)道的美國(guó)分離物GLRaV-3-NYl RdRp基因核苷酸與氨基酸序列相似性均在99％以上，氨基酸變異主要發(fā)生在N端；該C

6、P基因序列與已報(bào)道的3個(gè)GLRalV_3分離物CP基因核苷酸序列相似性均在99％以上，與巴西的一個(gè)分離物相似性為93％；CP氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果表明，5個(gè)GLRaV-3分離物序列中共有20個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異，其中，GLRaV-3-EDH CP中沒有變異位點(diǎn)。 2.從“品麗珠”樣品中克隆了GLRaV-2(GLRaV-3-CF)的RdRp基因。序列測(cè)定結(jié)果表明，GLRaV-3-CF RdRp基因全長(zhǎng)為1380 bp(GenBank登記

7、號(hào)為DQll6440)，推導(dǎo)其編碼459個(gè)aa；GenBank Blast(nr)檢索結(jié)果表明，該RdRp基因與已報(bào)道的GLRaV-2分離物GLRaV-2-PN和GLRaV-2-Sem的RdRp基因核苷酸相似性均為97.3％、氨基酸相似性分別99.7％和99.4％，與分離物GLRaV-2-93／955和GLRaV-2-RG的RdRp核苷酸相似性分別為92.9％和79.4％，氨基酸相似性分別為97.8％和94.9％；氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果

8、表明，5個(gè)GLRaV-2分離物的序列中共有33個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異，而GLRaV-2-CF RdRp中僅有1個(gè)變異位點(diǎn)。 3．原核表達(dá)分別獲得了大量的61 kDa(GLRaV-3 RdRp)、35 kDa(GLRaV-3 CP)、52 kDa(GLRaV-2 RdRp)和22 kDa(GLRaV-2 CP)重組融合蛋白。通過回收表達(dá)蛋白和免疫家兔，制備了GLRaV-3重組CP、GLRaV-2重組RdRp和CP的多克隆抗體。檢測(cè)葡萄樣品

9、中GLRaV-2和GLRaV-3的結(jié)果表明，所制備抗體均能有效識(shí)別相應(yīng)的病毒抗原，而由重組CP制備的抗血清檢測(cè)病毒的效果更好，病毒RdRp抗體的制備則為進(jìn)一步研究病毒與寄主互作及轉(zhuǎn)RdRp基因抗病毒機(jī)制等奠定了基礎(chǔ)。 4．獲得了轉(zhuǎn)GLRaV-2野生型和缺失編碼GDD的RdRp基因植株。對(duì)篩選到的抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性株率均在60％以上；對(duì)部分PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的抗性植株Southern雜交檢測(cè)陽(yáng)性率為75％，插入的拷貝數(shù)為1

10、～3個(gè)；轉(zhuǎn)入的基因在Southern雜交結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株中均能獲得正常轉(zhuǎn)錄，但轉(zhuǎn)錄水平有差異，從已檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因煙草來看，轉(zhuǎn)錄水平的差異與插入的拷貝數(shù)并無相關(guān)性；Westemblot檢測(cè)結(jié)果表明，野生型RdRp基因在轉(zhuǎn)基因煙草中大都能表達(dá)出目標(biāo)蛋白，且在不同轉(zhuǎn)基因植株中蛋白表達(dá)水平存在差異；而轉(zhuǎn)缺失GDD基元序列的RdRp基因煙草植株中均檢測(cè)不到表達(dá)的目標(biāo)蛋白。 5．“紅地球”、“黑奧林”、“美魯特”的再生研究結(jié)果表明，只有

11、“紅地球”的葉片、葉柄和莖段在培養(yǎng)基(C6)NN69+6-BA 2mg／L+IBA 0.2 mg／L+ADS 20.0 mg／L和(D6)NN69+ZT2.0 me．／L+IBA 0.1 mg／L+LH 500 mg／L上培養(yǎng)后，再生出了一定頻率的不定芽，其中葉片的再生率最高，為8.9％，其次是葉柄為4.8％，莖段的再生率最低，為1.5％0得到了轉(zhuǎn)GLRalV-3野生型RdRp基因煙草，對(duì)篩選到的轉(zhuǎn)基因植株Northern blot檢測(cè)

12、結(jié)果表明，野生型RdRp均能在煙草中正常轉(zhuǎn)錄。對(duì)“紅地球”、“黑奧林”、“美魯特”的初步轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，以優(yōu)化的轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)化葡萄獲得的抗性愈傷組織效率最高，均在21％以上；將獲得的抗性愈傷組織在D6培養(yǎng)基上均未誘導(dǎo)出再生植株，而在MS+TDZ 0.5mg／L+NAA 0.05mg／L+LH 100mg／L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化后，分別在由“紅地球”的葉片、葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織和由“黑奧林”的葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織中共誘導(dǎo)出4個(gè)抗性芽，在轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)